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《植物內(nèi)生菌DNA提取方法》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、在提取植物內(nèi)生菌之前，植物需要表面滅菌，其具體操作為將植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉溶液中1min，再將植物浸泡在70%酒精中1min，然后用硫代硫酸鹽/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1min。根和莖（土表面以上1cm處）都要滅菌處理，將根莖切成片狀。為了更好地分析細(xì)菌的位置，滅菌后莖表皮撕下，莖內(nèi)部按照之前的方法滅菌。表皮組織和根最后一次淋洗液中的細(xì)胞都用來提取DNA。植物不同組織的內(nèi)生菌群落DNA提取通過直接研磨植物組織，步驟為溶解、提取和純化步驟（方案一），或者在DNA提取前從片狀植物組織
2、中淋洗出細(xì)胞（方案二）。東南景天表面滅菌方法：整株植物用自來水沖洗30min，用蒸餾水洗3次，每次3min。用吸水紙吸去植物表面水分，用無菌剪刀在根基部將根系剪下，與植物地上部分開。將根系用70%酒精浸泡2min，無菌水洗3次，3%NaClO浸泡2次，每次1min，然后用無菌水沖洗3次，每次2min，最后一次清洗液涂LB平板。1.將2g左右消毒后植物組織于無菌研缽中，加5mL磷酸鈉緩沖液（19.9gNa2HPO4·H2O，1.27gNaH2PO4·2H2O，H2O定容到1L）研磨至勻漿。2.將植物勻漿轉(zhuǎn)移至50mL無菌離心管中，搖床200rpm振蕩
3、1-2h，使細(xì)菌細(xì)胞盡可能的從植物組織中釋放出來。3.取4mL懸液于新的無菌離心管中，12000×g離心10min收集菌體細(xì)胞。4.棄上清，將收集的菌體細(xì)胞重新溶于550μL1×TEbuffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10mgmL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。5.加入50μL20%SDS和8μL20mgmL-1蛋白酶K，混勻，65℃水浴3h，期間輕輕上下顛倒混勻數(shù)次。6.加入200μL5MNaCl，渦旋振蕩15s，12000×g離心10min。7．取上清液，并向上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），徹底混勻，12000
4、×g離心10min。8.上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，重復(fù)步驟7一次。9.上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，加入0.6倍體積（0.6vol）的冰冷的異丙醇，4℃放置1h。10.4℃，12000×g離心10min，棄上清。11.沉淀用70%冰乙醇清洗，離心，棄上清。12.DNA沉淀室溫風(fēng)干后，用無菌超純水溶解。13.DNA純化采用TIANquickMidiPurificationKit。微生物16SrRNA基因V5-V6-V7區(qū)域擴(kuò)增引物：799F2：GATGGCCATTACGGCCNNNNNN1193R：ACGCATCCCCACCTTCCTC用含10%
5、SDS提取緩沖液(NaP緩沖液)重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊。用直徑0.11mm的玻璃珠珠打操作50s，以溶解細(xì)胞。用苯酚-Tris(pH8)溶液和氯仿/異戊醇提取，用0.6vol的異丙醇和0.5mol/LNaCl通過沉淀再次獲得DNA。用70%的乙醇洗滌細(xì)胞團(tuán)塊，真空干燥，再溶解在50μl的超純水中。原始DNA提取物用Glassmilkpurificationkit(Bio101,LaJolla,CA)進(jìn)一步純化。所需試劑：Na2HPO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，10%SDS（十二烷基硫酸鈉），Tris飽和酚，氯仿/異戊醇（體積比24:1混合），異
6、丙醇，0.5mol/LNaCl，70%乙醇。苯酚、氯仿、異戊醇在DNA提取時的作用抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了
7、這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯
8、仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使
