[精品]羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備方法的探討

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1、羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備方法的探討羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備方法的探討【摘要】目的：探討羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備方法。方法:孕15、29周具有產(chǎn)前指征的50例孕婦，抽取羊水細(xì)胞培養(yǎng)6?7天，換液第二天取出觀察，見有許多大而亮圓的分裂期細(xì)胞時，加入秋水仙索繼續(xù)培養(yǎng)1小時后收獲、低滲、固定、制片、消化、染色。結(jié)果：50例羊水細(xì)胞培養(yǎng)全部成功，成功率100%。有49例獲得滿意的染色體分裂相。結(jié)論：該方法細(xì)胞培養(yǎng)成功率高、有效分裂相多、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、易于操作、成功率高?！娟P(guān)鍵詞】羊水細(xì)胞培養(yǎng)；染色體制備；方法文章編號:1009-5519（2008）15-2221-02中圖

2、分類號:R71文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A羊水細(xì)胞培養(yǎng)及其染色體制備技術(shù)是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的重要手段。由于羊水細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)耍求高、羊水中活細(xì)胞少、培養(yǎng)周期長、易污染、分裂相少；細(xì)胞收獲、低滲、固定、顯帶、染色諸多環(huán)節(jié)，相對于外周血染色體的制備，羊水細(xì)胞染色體制備的難度較大,任一環(huán)節(jié)不合適都可能導(dǎo)致失敗。針對上述情況，借鑒國內(nèi)外的一些經(jīng)驗(yàn)[廣5],我們摸索出了一種簡便、易行，提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備成功率的方法，收到良好效果，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1材料：（1）標(biāo)本來源：選擇來我院遺傳門診咨詢的15?29孕周，年齡25'45歲疑有染色體病胎兒的孕婦50例，其中

3、產(chǎn)前篩查后，風(fēng)險率大于1/270的40例，年齡大于35歲的孕婦10例。（2）培養(yǎng)器皿：CO2培養(yǎng)箱，純度99.99%的CO2,25ml培養(yǎng)瓶（CORNING,型號：3289）,離心機(jī)，倒置顯微鏡等。（3）試劑：羊水培養(yǎng)基購自浙江貝因美公司。20?滋吵011的秋水仙素，1%的檸檬酸三鈉,0.075mmol/L的KC1,0.25%的胰蛋白酶，固定液由甲醇與冰醋酸按3:1比例配成。1.2方法1.2.1標(biāo)本采集：囑孕婦平臥在手術(shù)床上，讓其左右翻身10次左右，以使羊膜腔內(nèi)脫落的細(xì)胞懸浮，在B超引導(dǎo)下，用7號穿刺針經(jīng)腹抽取羊水，先用5ml注射器抽出2ml羊水丟棄，再換用

4、20ml注射器抽取羊水20ml,并迅速送到無菌間。1.2.2羊水細(xì)胞培養(yǎng)：（1）細(xì)胞收集：在生物安全柜內(nèi)，將羊水注入2只15ml無菌離心管中，每只10ml,1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘，棄上清，留0.5ml,用無菌吸管輕輕吹打混勻。（2）接種：將混勻的羊水細(xì)胞接種于2個25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml羊水培養(yǎng)液，輕輕混勻。（3）培養(yǎng)：酒精燈過火瓶口，擰緊瓶蓋臥式靜置于C02培養(yǎng)箱中，溫度37°C,C02濃度5%,培養(yǎng)6、7天后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況。（4）細(xì)胞培養(yǎng)情況觀察：細(xì)胞培養(yǎng)6~7天后方可在倒置顯微鏡下觀察。此時，可見瓶底貼壁細(xì)胞已形成6、10個克隆

5、，可換液。無菌操作將瓶內(nèi)液體收集于1個15ml無菌離心管，重新加入4ml羊水培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)「2天，鏡下可見較多大而亮圓的分裂期細(xì)胞，可終止培養(yǎng)進(jìn)行收獲。換液吋換下的培養(yǎng)液可重新離心后將細(xì)胞接種于一個25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)6?8天后仍會有新的細(xì)胞貼壁，并形成克隆，能有效防止第?次羊水細(xì)胞收集及染色體制備失敗。（5）終止培養(yǎng)：每瓶加秋水仙素（20?滋g/ml）40?滋1,旋緊瓶蓋37°C繼續(xù)培養(yǎng)1小吋。1.2.3羊水細(xì)胞收獲：將羊水細(xì)胞培養(yǎng)液倒入一個干凈離心管中,用吸管吸干凈，快速將37°C溫?。?0分鐘以上）的0.25%的胰蛋口酶和1%的檸檬酸

6、三鈉1：9混合液1ml加入培養(yǎng)瓶中，輕搖培養(yǎng)瓶，使消化液與培養(yǎng)瓶底面充分接觸，立即放冋37°C培養(yǎng)箱屮溫浴0.5~1分鐘，取出培養(yǎng)瓶，將上述離心管中的培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)瓶中，輕搖培養(yǎng)瓶，終止胰蛋白酶的消化作用，用細(xì)胞刮片輕輕刮下細(xì)胞。用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄上清，保留細(xì)胞沉淀。1.2.4低滲：加入37°C預(yù)溫30分鐘以上的0.075MKC1低滲液7ml,用吸管輕輕吹勻細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮于低滲液中，放回37°C溫浴箱屮，靜止30分鐘。1.2.5預(yù)固定：沿管壁緩慢加新鮮固定液（冰醋酸：甲醇二3:1）1.5ml,用氣泡輕輕吹

7、打溶液使其混勻；1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘。然后吸棄上清液，保留沉淀。1.2.6固定：沿離心管壁加入新鮮固定液5.5ml,用氣泡吹勻，繼續(xù)固定30分鐘。1000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。棄上清液，保留沉淀。1.2.7再固定：再加入新鮮固定液5.5ml,用氣泡吹勻，靜止30分鐘。1000轉(zhuǎn)/分，10分鐘。棄上清，保留沉淀。1.2.83次固定：加入新鮮固定液0.5ml制成細(xì)胞懸液。1.2.9滴片、烤片和顯帶：用滴管吸細(xì)胞懸液2?3滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上，立即用口吹散，并在酒精燈的火焰下過火幾次，置75~80°C烤箱屮烤片2小時。用預(yù)溫15分鐘的0.01%的

8、胰蛋白酶消化25?30秒，Giemsa染色液染色10