western blot 詳解

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1、Westernblot實驗介紹及流程垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置電泳槽玻璃板、梳子、加樣校準(zhǔn)架等電轉(zhuǎn)移槽切膠板、黑白夾板、海綿墊等電泳儀用途：用于生物學(xué)實驗中對特定目的蛋白質(zhì)的分離，定性及定量的檢測分析，是Western-blot（蛋白免疫印跡）實驗中非常重要的部分。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體（一抗）起免疫反應(yīng)，再與酶或

2、同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。Westernblot實驗原理抗原一抗生物素標(biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑Westernblot檢測蛋白表達實驗流程SDS-PAGE電泳的基本原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠是在PAGE凝膠中引進SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負(fù)電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)，在含有強還原劑的溶液中可與蛋白質(zhì)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶

3、有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。PAGE：聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bi

4、s）；催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。一配分離膠準(zhǔn)備物品：玻璃板洗衣粉灌膠架移液槍兩個燒杯（1ml200ul20ul）30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=8.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常溫）1清洗玻璃板：一

5、只手扣緊玻璃板，另一只手蘸洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用ddH2O沖洗干凈后立在通風(fēng)處或烘箱中2配制分離膠：玻璃板對齊后放入夾中加緊，注意使兩玻璃板對齊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。先配制分離膠。配方如下：具體情況依照說明書灌分離膠：用1ml的移液槍吸取1ml膠沿玻璃放出，溶液緩慢加入到裝配好的玻璃板中至凝膠高度為6cm左右，預(yù)留1.5cm高度配制濃縮膠。用1ml的移液槍吸取1ml左右的異丙醇，壓平。沿玻璃放出，注意速度要慢，否則膠會被沖變形。溫箱放置0.5-1h左右至聚合完全。注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠，灌膠速度須緩慢，避免產(chǎn)生氣泡灌膠之上輕

6、輕加一層異丙醇，用來壓平灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%二配制濃縮膠準(zhǔn)備物品：移液槍燒杯（1ml200ul20ul）Tips：30%Acrylamide1M（4度冰箱），Tris-HCL溶液（PH=6.8），ddH2O10%AP（-20冰箱），TEMD（4度），SDS（常溫）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已經(jīng)凝了。傾倒掉膠上層的異丙醇，后用吸水紙吸干。注意吸水紙不要觸碰分離膠10%的分離膠配合6%的濃縮膠使用。配制濃縮膠，配方如下：6%的濃縮膠4mlddH2O2.39ml30%Acrylamide0.544ml1MTris-HCL溶液（PH

7、=6.8）1.02ml10%APS40.82ulTEMD2.04ul配膠方法同上，各種溶液加入到燒杯中，后震蕩。灌濃縮膠：用1ml的移液槍將玻璃板中的剩余空間灌滿濃縮膠，灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。冰箱過夜待濃縮膠凝固后，取保險膜鋪平于桌上，另取兩張草紙鋪于保鮮膜上。用ddH2O浸濕草紙。取玻璃板放于草紙上，包好。放入4℃冰箱過夜。濃縮膠的濃度比較低（5%丙烯酰胺-甲叉雙