酶工程_酶分子定向進(jìn)化

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1、酶分子定向進(jìn)化Directedevolutionenzyme酶分子定向進(jìn)化酶分子定向進(jìn)化又稱(chēng)為酶分子體外進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，是蛋白質(zhì)工程的新策略，是在試管中模擬達(dá)爾文進(jìn)化的過(guò)程，利用分子生物學(xué)手段在分子水平創(chuàng)造分子的多樣性，結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變體。與傳統(tǒng)的理性設(shè)計(jì)相比，它不需事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等因素，而是人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，產(chǎn)生基因多樣性，并結(jié)合定向篩選（或選擇）技術(shù)，獲得具有某些預(yù)期特征的改構(gòu)酶。生物的自然進(jìn)化進(jìn)化過(guò)程：突變→自然選擇→遺傳后代進(jìn)化結(jié)果：

2、基因多樣性：為完成同一功能所表現(xiàn)出的多個(gè)基因或同一個(gè)基因(同源性)代謝途徑的多樣性：同樣產(chǎn)物，多條途徑代謝產(chǎn)物的多樣性：同一底物，不同產(chǎn)物生物多樣性：整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中的生物酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)酶的合理設(shè)計(jì)體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開(kāi)發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱(chēng)實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過(guò)人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體

3、外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問(wèn)題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開(kāi)辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。定向進(jìn)化的原理在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對(duì)功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作

4、用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過(guò)程完全是在人為控制下進(jìn)行的DNA改組和外顯子改組DNA改組（DNAshuffling）又稱(chēng)有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過(guò)DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個(gè)或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exonshuffling）類(lèi)似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進(jìn)行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白

5、質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動(dòng)，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個(gè)基因片段上。定向進(jìn)化的選擇策略1、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過(guò)選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢(shì)，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類(lèi)，降低突變率，縮小突變庫(kù)的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見(jiàn)光信號(hào)的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。高通量的篩選體系酶性　　質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯(cuò)PCRβ-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專(zhuān)一性DNA

6、改組枯草桿菌蛋白酶BPN′穩(wěn)定性盒式誘變對(duì)硝基苯酯酶底物專(zhuān)一性/有機(jī)相活性易錯(cuò)PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專(zhuān)一性盒式誘變?chǔ)?半乳糖苷酶底物專(zhuān)一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專(zhuān)一性易錯(cuò)PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/定位誘變藥物和疫苗活性/專(zhuān)一性/最佳表達(dá)DNA改組酶的體外定向進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例回本章目錄分子進(jìn)化工程的種類(lèi)人工獲取新基因的方法常規(guī)的基因工程方法生物功能蛋白質(zhì)基因新基因的理性設(shè)計(jì)和人工合成根據(jù)已有基因的序列和功能進(jìn)行設(shè)計(jì)基因的直接進(jìn)化（directedevolution)可使已有基因獲得新的特性可獲得自然界中不存在的基因可解決許多新的理

7、論和應(yīng)用問(wèn)題基因直接進(jìn)化的用途提高酶活性——天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對(duì)映異構(gòu)體選擇性——酯酶可水解非天然酯類(lèi)改善酶的工藝性——冷適應(yīng)和熱適應(yīng)酶改變酶的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)——二體酶變?yōu)閱误w酶獲取許多新的理論知識(shí)基因直接進(jìn)化的用途提改變酶的特性----多功能或單功能酶高酶活性---天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性提高30倍改變底物特異性和對(duì)映異構(gòu)體選擇性----酯酶可水解非天然酯類(lèi)改變酶的工藝性----冷適應(yīng)和熱適應(yīng)酶改善酶的穩(wěn)定性----二體酶變?yōu)閱误w酶或單體酶