實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)純化 鹽析沉淀法

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1、實(shí)驗(yàn)四蛋白質(zhì)純化鹽析沉淀法【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹坎捎昧蛩徜@鹽析法將日本血吸蟲谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合蛋白從大腸桿菌BL21（DE3）pGEX-NS53細(xì)胞裂解液中分離出來，使學(xué)生學(xué)習(xí)掌握制備細(xì)胞裂解液的技術(shù)和采用鹽析法從中分離目的蛋白質(zhì)的技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】用鹽析法從成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液（如細(xì)胞裂解液）中提取目的蛋白質(zhì)是一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。此種技術(shù)的工作原理如下：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會(huì)隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱作鹽溶。但是當(dāng)鹽的濃度繼續(xù)增高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象是由

2、于蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間存在靜電力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團(tuán)之間的靜電力受鹽離子的影響而被消除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團(tuán)的電荷被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如0-25%飽和度的硫酸銨）使部分雜質(zhì)呈“鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來，經(jīng)離心法去除。而目的蛋白質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如25-60%飽和度的NH4SO4）使目的蛋白質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來。在鹽析時(shí)，蛋

3、白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度的關(guān)系，可用下式表示：Slg=-Ks×IS0式中的S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I的溶解度，S0蛋白質(zhì)在純水（離強(qiáng)度為0）中的溶解度；KS為鹽析常數(shù)。離子強(qiáng)度I可用下式表示：I=1/2∑Z2式中，M-溶液中各種離子克分子濃度Z-各種離子所帶的電荷數(shù)在溫度恒定時(shí)，S0對(duì)于某一種蛋白質(zhì)在某一溶液中的溶解度是一個(gè)常數(shù)，lgS0也為一常數(shù)，以β代替，故式（1）可以改寫為：lgS=b-Ks×I（3）β值主要與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽離子的平均半徑以及鹽離子的電荷數(shù)有關(guān)，也受溶液中的氫離子濃度（PH值）和溫度影響。一般來說，蛋白質(zhì)在某一鹽溶液中的鹽析系數(shù)

4、--KS越大，鹽析效果越好。由于蛋白質(zhì)含有許多親水基團(tuán)，需要在較高的I植下才能從溶液中析出。由式（3）可以看出，在一定的溫度和PH值下，改變鹽的離子強(qiáng)度（I）可以把不同的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來。此種方法稱為“KS分段鹽析法”,常用于蛋白質(zhì)的初步提純。在一定的的I值下，改變溫度及PH值，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來，稱為“β分段鹽析法”，常用蛋白質(zhì)純化過程的后期，特別是某些蛋白質(zhì)結(jié)晶析出時(shí)。蛋白質(zhì)鹽析常用硫酸銨等中性鹽。硫酸銨因其溶解度大（25℃時(shí)的飽和硫酸銨溶液的摩爾濃度為4.1M，即767克/升，0℃時(shí)為3.9M，676克/升），溫度系數(shù)小而被廣泛使用。硫

5、酸銨價(jià)格便宜，不易引起蛋白質(zhì)變性并具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，分段效果比其他鹽類好，廢液可以作肥料，對(duì)環(huán)境無污染。其缺點(diǎn)是，其NH+4對(duì)用凱氏定氮測定蛋白質(zhì)含量有干擾，硫酸銨溶液的PH常在4.5-5.5之間,其緩沖能力比較差。有時(shí)用硫酸鈉.。蛋白質(zhì)鹽析時(shí),鹽的濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時(shí)，溶液飽和度調(diào)度方法有三種，一是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，需調(diào)正的濃度不高時(shí)，可以向蛋白質(zhì)溶液中添加飽和鹽溶液。另一種方法是向蛋白質(zhì)溶液中直接添加磨碎的鹽結(jié)晶粉末，此種方法用于需要的鹽濃度高，而且蛋白質(zhì)溶液體積不宜過分增加時(shí)。第三種方法是將待鹽

6、析蛋白質(zhì)的溶液裝于透析裝內(nèi)對(duì)飽和硫酸銨進(jìn)行透析，此法鹽濃度變化比較連續(xù)平穩(wěn)，不會(huì)出現(xiàn)局部過高現(xiàn)象。但是鹽析時(shí)需要測定鹽的飽和度，過程復(fù)雜，較少應(yīng)用。采用方法一時(shí)，所需添加的飽和鹽溶液的體積可按下式計(jì)算：S2-S1V=V01-S2式中，V——飽和鹽溶液的體積V0——原溶液的體積S1——原溶液的飽和度S2——要達(dá)到的飽和度采用第二種方法時(shí)，可從附表一中選擇要達(dá)到某一濃度時(shí)所需添加的固體硫酸銨量。影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：（1）蛋白質(zhì)溶液中鹽的濃度。不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。從成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液中分離蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度應(yīng)由稀到濃漸次增加。每出現(xiàn)一種蛋

7、白質(zhì)沉淀就應(yīng)將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀出來；（2）蛋白質(zhì)溶液的PH值。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小而容易沉淀出來，因此鹽析時(shí)應(yīng)將PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近；（3）蛋白質(zhì)濃度。在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易被鹽析沉淀。但是濃度太高時(shí)，易使雜蛋白共沉淀；（4）溫度。濃鹽溶液對(duì)蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，因此一般的鹽析操作可以在室溫下進(jìn)行?！緦?shí)驗(yàn)器材】100ml燒杯，50ml離心管，高速冷凍離心機(jī),微量離心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝膠電泳儀一臺(tái),1ml,200μl,20μl移液器各1把,1ml,200

8、μl和20μl槍各1支,微量離心管支架,磁力攪拌器及攪拌磁棒?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．大