分子生物學(xué)課件

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1、基因操作原理及相關(guān)技術(shù)Parttwo:1基因操作(genemanipulation)基因工程(geneengineering)遺傳工程genecloningmolecularcloning基因操作的核心部分為重組DNA技術(shù)。RecombinationDNAtechnology2基因工程與建筑工程生物反應(yīng)器3DNARecombination1定義：對目的基因進(jìn)行體外重組，再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使這個基因在受體細(xì)胞中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的過程?？寺。╟lone）：n,無性繁殖系及其后代?；蛲耆嗤?v,指從同一祖先產(chǎn)生這類同

2、一的DNA分子群或細(xì)胞群的過程。（Gene,cell,個體）20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個分支學(xué)科。4理論上三大發(fā)現(xiàn)：Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗：證實了遺傳物質(zhì)的本質(zhì)是DNA（1944年）Watson和Crick：提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（1953年）Nirenberg等：確定了遺傳信息的傳遞方向（1961-1966年）DNARNA蛋白質(zhì)5技術(shù)上三大發(fā)明：工具酶：分子手術(shù)刀，切割與縫合基因，包括限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，對DNA或RNA進(jìn)行各種各樣的修飾。載體(vector,vehicl

3、e)：本意是媒介體，在基因工程上指能將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的DNA分子。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription,RT)：打破了中心法則，使真核基因制備成為可能，RT-PCR。RNADNA6genemanipulation過程1、目的基因的獲?。≒CR,genelibrary)；2、載體(vector)的選擇與構(gòu)建(工具酶等）；3、目的基因與載體連接，構(gòu)建重組DNA分子；4、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子篩選；5、受體細(xì)胞中目的基因的功能表達(dá)。7基因工程的基本過程分(合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒8重組DNA技術(shù)的意義打

4、破了自然種的界限真核/原核生物間基因的交流對生物進(jìn)行定向改造基因治療（基因矯正/添加，RNAi）基因工程藥物（生長激素，細(xì)胞生長因子，重組疫苗等）9組織纖溶酶原激活物（tissueplasminogenactivator，tPA）Oneexample---10How？載體，工具酶11基因操作的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)DNA聚合酶連接酶（Ligase）反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端轉(zhuǎn)移酶等121、限制性內(nèi)

5、切酶定義：是一類能夠識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶。EcoRI,HandIII,SalI13命名：3-4個字母組成,方式是:屬名+種名+株名+序號第1字母（大寫）產(chǎn)生該酶細(xì)菌的屬名的第一字母；第2、3字母（小寫）細(xì)菌的種名；第4字母（大寫）細(xì)菌菌株名；羅馬數(shù)字代表該菌株中發(fā)現(xiàn)的第幾個酶。EcoRI:EscherichiacoliR(大腸桿菌R株)14限制與修飾（Restriction-modification）細(xì)菌體內(nèi)存在限制和修飾系統(tǒng)（R-M）對自身的DNA進(jìn)行甲基化修飾，免受自己限制酶的分解，對外來的D

6、NA通過限制性內(nèi)切酶降解，一般是指對外源DNA侵入的限制。應(yīng)用：正是對限制和修飾現(xiàn)象的深入研究，導(dǎo)致限制性內(nèi)切核酸酶的發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用甲基化處理保護(hù)免受限制性內(nèi)切酶降解15分類根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶的作用特點，分為三大類。16I類限制性內(nèi)切核酸酶Ⅲ類限制性內(nèi)切核酸酶17是基因工程中最常用的酶，該類酶的分子量小，專一性強,切割的方式有平切和交錯切。Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶:18Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶識別序列的長度：一般為4-8個堿基，最常見6個堿基。識別序列的結(jié)構(gòu)：大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)，切割位點在DNA兩條鏈相對稱的位置。回文結(jié)構(gòu)：一條單鏈以

7、中心軸對折可以形成互補的雙鏈。19粘性末端（cohesiveend）--在DNA雙鏈的不同位置切割DNA，形成有單鏈突出的末端。平末端（Bluntend）--在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子。限制酶產(chǎn)生的末端：20常用的限制性內(nèi)切酶21DNA連接酶（ligase）作用：使DNA的3’羥基末端和5’磷酸末端形成3’-5’磷酸二酯鍵，將兩段DNA連接起來種類：T4DNAligase（噬菌體來源）E.coliDNAligase注意：連接DNA片段是否粘端；反應(yīng)溫度（16℃）和時間2223DNA聚合酶復(fù)制（DNAReplicati

8、on）:親代DNA雙鏈分子(D.SDNA)在DNA聚合酶的作用下，分別以每單鏈DNA分子(S.SDNA)為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP，合成兩條與親代分子完全相同的子代DNA分子的過程。24DNA5’…ATGACTG…3’3’…TACTGAC…5’RNA5