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1、ZORBAX方法開發(fā)策略兩個或多個色譜峰的分離度取決于三個因素：柱效、選擇性和保留時間。ZORBAX色譜柱涵蓋了各種類型的鍵合相，用于優(yōu)化選擇性和保超時間-這是實現(xiàn)最佳分離度的關(guān)鍵所在。這些色譜柱具有各種粒徑(從1.8-7pm),可以提供任何分離所需要的柱效。從低pH(pH2?4)開始方法開發(fā)既然有如此多種選擇，那么您怎樣選擇一個色譜柱進行方法開發(fā)呢？方法開發(fā)吋，推薦以低pH的緩沖液流動相為起點?約pH2-3o因為使用低pH的流動相時，堿性化合物在硅膠基質(zhì)色譜柱上具有最佳峰形。在低pH條件下，硅膠上的硅疑基完全質(zhì)了化，因此帶
2、正電荷的堿性化合物與硅疑基的作用力不大。產(chǎn)生良好的峰形。許多酸性化合物不帶電荷，在低pH條件下的保昭時間最長。這些現(xiàn)象是在低pH條件下進行方法開發(fā)的主要優(yōu)勢。對于標準分析實驗，開始方法開發(fā)時應以乙膳作為流動相的冇機改性劑和以25?50mM的磷酸鹽緩沖液(pH2-3)作為水相。此條件下pH穩(wěn)定，這對可離了化化合物進行重現(xiàn)性分析是必要的。首選ZORBAXEclipsePlus柱以獲得最佳峰形首選ZORBAXEclipsePlusC18或C8色譜柱，川于低pH條件下的方法開發(fā)。EclipsePlus色譜柱是Eclipse家族的最新
3、成員，它采用了改進的硅膠和鍵合工藝，對堿性化合物的分析具有良好的峰形。EclipsePlus色譜柱可以在pH2-9范圍內(nèi)使用，訃方法開發(fā)更具靈活性。他們可以在低至pH2的條件下仍然穩(wěn)定性，因此是初始方法開發(fā)的理想之選。在低pH條件下優(yōu)化溶劑和鍵合相初始方法開發(fā)步驟，可能很快就獲得滿意的分離。但是，如果需要進一步優(yōu)化，可以將乙臘替換為甲醇或四氫咲喃，然后分離就再次獲得了優(yōu)化。此步可能會獲得滿意的方案，但是，如果仍然需要進一步優(yōu)化，那么可以改變色譜柱鍵合相。在低pH條件下，可以選擇多種鍵合和進行優(yōu)化。這些鍵合和包括Eclipse
4、Plus鍵合相，也包括的EclipseXDB家族鍵合相(帶68、C8、苯基和CN)。備用選擇包括六種不同的StableBond鍵合相:SB-C18>SB?C8、SB-PhenykSB?CN、SB?C3和SB?Aq。在低pH條件下可能需要改善酸性化合物的保留。對于此情況，則將pH降的更低，低至pH1-2,并H使用StableBond色譜柱。這些色譜柱可以在非常低的pH條件下具冇極高的穩(wěn)定性和可以為實現(xiàn)最高分離度的分離提供多種選擇性。在中等pH(4-9)條件下進行方法開發(fā)ZORBAXEclipsePlus柱有些樣品可能在低pH條
5、件下不溶解，或者在屮等pH條件卜?具有更好的溶解性和穩(wěn)定性。盡管仍然采用EclipsePlusC18色譜柱，但可以采用中等pH范用進行方法開發(fā)。EclipsePlus色譜柱可以在高達pH9的條件下穩(wěn)定，因此它在中等pH條件下是相當可靠的。這些雙封尾的色譜柱有兩個主要優(yōu)勢?既可以在低和中等pH條件下穩(wěn)定，也具冇足夠的鍵合密度以阻止pH6-9條件下硅膠溶解。在中等pH條件下，堿性化合物(例如胺類)可能仍帶有正電荷，陽硅膠表面的硅疑基可能帶有負電荷。因此盡可能多地掩蔽硅疑基才能在中等pH條件下獲得最佳峰形。這使得EclipsePl
6、usC18色譜柱成為中等pH條件下最佳的啟始色譜柱。磷酸鹽緩沖液一般是pH7吋的首先流動相，因為它的緩沖范圍是pH6.1-在小等pH條件下，乙酸鹽緩沖液為第二選擇，因為它的緩沖范圍為pH3.8-5.8o而且乙酸鹽貝有良好揮發(fā)性，可以被LC/MS兼容，使他成為良好的選擇。備用選擇——ZORBAXEclipseXDB■苯基、CN利IBonus?RP在中等pH條件下進行方法開發(fā)的過程與在低pH條件下方法開發(fā)的過程相似，先優(yōu)化冇機改性劑，如果沒有達到所需的分離度，再選擇備用鍵合相。在屮等pH條件下的備用鍵合相為：ZORBAXEcli
7、pseXDB-苯基、CN和Bonus-RPo他們對對許多樣品的提供非常不一樣的選擇性。重新進行一遍Z前的方法開發(fā)過程。Bonus-RP色譜柱具冇極性包埋的酰胺基團，對許多樣品具冇不同的選擇性、對堿性化合物具有良好的峰形和能在100%水和流動和屮使用。在高pH(9-12)條件下進行方法開發(fā)選擇ZORBAXExtend?C18色譜柱在低或中等pH條件下，某些堿性化合物的分離可能仍然保留不足或選擇性不好。對于這些樣品，可能適合采用高pH條件進行分離。在此之前，硅膠在高pH條件的分離被禁止使用，因為潛在的硅膠溶解，導致色譜柱壽命短。
8、最新的色譜柱技術(shù)(如ZORBAXExtend?C18)對以防止硅膠溶解，因此，可以達到正常的色譜柱壽命和可以開發(fā)高pH條件下選擇性的優(yōu)勢。在高pH條件下，Extend-C18色譜柱可以選擇的流動相緩沖液為冇機鹽緩沖液，如三乙胺和紅氧化餒。這些緩沖液最適合與甲醇為有機改性劑的流動相一起使用，
