植物葉綠體DNA的提取

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1、實(shí)驗(yàn)1植物葉綠體DNA的提取、PCR擴(kuò)增與電泳觀察【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、學(xué)習(xí)從新鮮的綠色葉片中提取葉綠體DNA的方法2、學(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA的操作方法3、學(xué)習(xí)和掌握PCR實(shí)驗(yàn)的原理和操作方法【實(shí)驗(yàn)原理】葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳物質(zhì)——葉綠體基因組DNA（ctDNA），大小在120～160kb，其DNA分子都是以共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈形式存在。由于cpDNA相對(duì)保守及其重要功能，已被廣泛用于細(xì)胞質(zhì)遺傳、植物的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性和親緣關(guān)系等多方面的研究，而獲得純度高、產(chǎn)量好的、結(jié)構(gòu)完整的ctDNA是開(kāi)展相關(guān)研究的

2、前提條件。然而ctDNA的提取是限制深入研究的重要因素，傳統(tǒng)的提取方法包括梯度離心提取ctDNA的方法，對(duì)設(shè)備要求高，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)．產(chǎn)率低。因此，我們要盡可能快速、簡(jiǎn)便地獲得質(zhì)純、量大的ctDNA．一般來(lái)說(shuō)獲得純度高、濃度大的葉綠體DNA很難，主要是因?yàn)槿~綠體DNA含量太少同時(shí)在提取中有諸多因素干擾(如：核DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改進(jìn)部分傳統(tǒng)操作，提取葉綠體基因組DNA，同時(shí)利用瓊脂糖凝膠電泳及PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)提取效果?！緦?shí)驗(yàn)儀器與試劑】1、器材：剪刀、燒杯、移液器、槍頭、量筒、勻漿器、紗布、300目尼龍網(wǎng)、注射器、離心管、濾膜2、試

3、劑：①酶液：1%纖維素酶、0.6mM蔗糖、8mMCaCl2·2H2O、10mMNaH2PO4·2H2O，pH5.6②洗滌液：0.6mM蔗糖、8mMCaCl2·2H2O、2mMNaH2PO4·2H2O，pH5.6③10%SDS④溶液A：25mMEDTA，50mMTris，pH=8.0⑤Tris飽和酚，氯仿，異丙醇，TE，瓊脂糖，goldview，Loadingbuffer，DNAmarker⑥新鮮葉片⑦PCRBuffer、Mg2+、dNTP、上、下游引物、ddH2O、TaqDNA聚合酶【實(shí)驗(yàn)步驟】一、葉片采集采集適量新鮮綠葉（約10g）二、細(xì)胞破碎首

4、先利用剪刀將葉片剪碎，然后放于勻漿器中，先加入不含酶的酶液進(jìn)行勻漿，棄渣，將液體轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入纖維素酶至終濃度為1%后攪拌均勻，50度水浴約30分鐘。一、葉綠體分離將經(jīng)酶液處理的液體取出，依次用紗布和300目尼龍網(wǎng)與大注射器過(guò)濾，取濾液。1、用電組：將上述濾液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，3000rpm離心3分鐘，棄上清。用10mL洗滌液重懸洗滌后3000rpm離心3分鐘，棄上清，洗滌兩次后，即分離得到葉綠體。2、不用電組：利用大注射器及0.2μm濾膜過(guò)濾上述濾液后，將濾膜上的葉綠體刮下，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，即分離得到葉綠體。二、DNA提取1、

5、用電組：①向葉綠體中加入500μL溶液A把葉綠體懸浮，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。②加入200μL10%SDS（裂解葉綠體膜，釋放DNA），混勻后靜置2min；③加入350μL苯酚（使蛋白質(zhì)變性）+350μL氯仿（與苯酚互溶，易于除去苯酚），混勻，10000rpm離心2min；④轉(zhuǎn)移上層液體至新的離心管中，加入等體積氯仿（去除苯酚），混勻，10000rpm離心2min；⑤轉(zhuǎn)移上層液體至新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇（沉淀DNA）沉淀10min；⑥10000rpm離心5min，棄上清；⑦加入500μL70%乙醇（去除鹽離子）洗滌沉淀，10000r

6、pm離心5min，晾干；⑧30μLTE溶解DNA；1、不用電組：①向葉綠體中加入500μL溶液A把葉綠體懸??；②加入200μL10%SDS，混勻后靜置2min；③加入適量KI固體至飽和后靜置至出現(xiàn)明顯分層；④將下層透明液體轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中，用洗耳球?qū)⒁后w吹出，DNA吸附于硅膠膜上，棄液體；⑤向吸附柱中加入500μL70%乙醇，用洗耳球吹出，棄液體，晾干；⑥將吸附柱至于新的1.5mL離心管中，用30μLTE溶解DNA，用洗耳球?qū)⒁后w吹入離心管中。三、PCR擴(kuò)增特征條帶25μL體系：PCRBuffer2.5μLMg2+1.5μLdNTP2.0μL上

7、、下游引物各2.5μL加至PCR管中ddH2O8.0μLTaqDNA聚合酶1.0μLDNA模板5.0μLPCR結(jié)束后，取5μL在O．8％的瓊脂糖上電泳，觀察。一、葉綠體DNA的電泳觀察取提取的葉綠體DNA5μL在O．8％的瓊脂糖上電泳，電泳1h后，使用自制的LED燈進(jìn)行觀察?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與討論】1、為保證葉綠體DNA的含量和純度，在本實(shí)驗(yàn)操作中，樣品前處理、抽提、純化等操作中應(yīng)注意什么？2、提取不同種植物的葉綠體DNA，比較、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。