山東花生腐霉根腐病病原鑒定

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山東花生腐霉根腐病病原鑒定摘要：利用組織分離技術和選擇性培養(yǎng)基純化技術對山東地區(qū)花生腐霉根腐病的病原菌進行了分離和純化。按照柯赫法則，根據(jù)余永年真菌形態(tài)學鑒定方法及利用ITS序列比對等分子生物學方法對病原菌進行了鑒定。結果表明，引起山東地區(qū)花生腐霉根腐病的病原菌為群結腐霉（PythiummyriotylumDrcchslcr）、旋柄腐霉（Py〃血加Drcchslcr）、畸雌腐霉（Py/加“加irrgMd"Buisman）以及終極腐霉CPythiumultimumTrow）。關鍵詞：花牛；腐霉；根腐?。昏b定IdentificationofPeanutPythiumRootRotPathogeninShandongAbstract：PathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasisolatedandpurifiedbytechniquesoftissueisolationandselectivemedia.BasedonKochesrule,thepathogenwasidentified.bythemethodsofFungalmorphologicalandITSsequencealignment.AnditindicatedthatthepathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasPythiummyriotylumDrechsler>PythiumhelicoidesDrcchslcr>PythiumirregulareBuismanandPythiumultimumTrow.Keywords:peanut;Pythium;rootrot;identification近年來，隨著種植花生經(jīng)濟效益的不斷提高，山東省的花生種植面積也在不斷增長，目前主要劃分的兩大優(yōu)勢區(qū)域，一是以種植春花生為主的膠東半島、魯中和魯東南地區(qū)的29個縣；二是以種植夏花生為主的魯西和魯西南地區(qū)黃河故道的5個縣。其小花生腐霉根腐病是影響山東花生產(chǎn)量的主要因素Z-,由于種植而積大，產(chǎn)區(qū)集中，連作面積廣，給花生生產(chǎn)造成了很大危害?；ㄉ坎『φ{查分離時，我們從以上大部分地區(qū)的花生病株中分離到了腐霉菌（PW加Msp）,為了明確山東省花生腐霉根腐病的病原特征及生物學特性，為防治提供依據(jù)，作者于2007-2009年度對山東花生腐霉根腐病病原進行了研究，結果報道如下。1材料與方法1.1癥狀表現(xiàn)調查方法對山東地區(qū)不同花生產(chǎn)區(qū)的花生進行出間病害調查并采集發(fā)病樣本，記錄花生從播種到收獲是否能受到腐霉的侵染而發(fā)病，被害植株是否萎驚，須根的腐爛情況以及初生根、次生根和主根的尖端是否特別容易受害，根系是否完全被破壞[1]O1.2病原菌分離與純化方法 將從田間采集的病株須根系用H來水沖洗干凈，用吸水紙吸干表而的水珠，將病株須根系剪成長5mm的小塊，將其放置于VP?選擇性培養(yǎng)基中〔2]25°C培養(yǎng)。24h后不斷觀察，發(fā)現(xiàn)有腐霉長出立即轉移到CMA培養(yǎng)基上放在25°C恒溫箱中培養(yǎng)，純化，轉入CMA斜面培養(yǎng)，5d后菌絲長滿，放入4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?.3病原菌致病性測定方法按照柯赫法則⑶，采用盆栽接種測定方法測定病原菌的致病性，將土壤滅菌后裝屁盆，種屁生（屁育22）,花生團棵后，把4°C保存的菌種在CMA培養(yǎng)基上25°C擴繁，長滿菌絲后按4%（菌:±）的接種量，與花盆內的土壤混勻，保濕筒保濕48h后調查發(fā)病情況，調查持續(xù)一周，從病組織分離回接菌種，并作單菌絲培養(yǎng)。1.4病原菌種類鑒定方法1.4.1病原菌最適溫度及pH值測定將PDA培養(yǎng)基制成平板。將事先培養(yǎng)好的直徑5mm的病菌圓餅轉接在平板中央，分別置于4°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C和35°C進行病原菌最適生長溫度測定。在將PDA培養(yǎng)基的pH值調至3-12,按照上述方法將接好菌餅的培養(yǎng)皿置于25°C恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，定期觀察，記錄菌落生長速率以及菌落形態(tài)特征。1.4.2病原菌形態(tài)觀察將腐霉菌在CMA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3d后移取邊緣菌絲至皮氏（Petri）培養(yǎng)液中，25°C培養(yǎng)1?3d挑取砲子囊，觀察抱子囊形態(tài)，有無層出現(xiàn)象，游動抱子的游出方式,并且測量砲子囊大小。待出現(xiàn)藏卵器、雄器、卵抱子后,觀察藏卵器、雄器的形態(tài)，著生位置，配合情況及卵砲子的形態(tài)特征，每項指標分別觀察測量100個，并且測量其大小，計算平均值⑷。鑒定則依據(jù)抱子囊、藏卵器、雄器、卵孑包子的形態(tài)特征，大小及其特性來鑒定，主要參考《中國真菌志》（第六卷，科學出版社，余永年主編）進行鑒定⑴。1.4.3病原菌ITS序列測定將事先用CMA平板培養(yǎng)好的病原菌的菌落刮取下來，利用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、ITS4)進行PCR擴增，最后利用Biospin膠冋收試劑盒進行冋收并測序⑹。鑒定則參照NCBI(美國國立生物技術信息中心)中的ITS序列，利用DNAstar 等相關軟件進行相似序列比對。2結果與分析2.1癥狀表現(xiàn)出間調查我們發(fā)現(xiàn)，魯東南地區(qū)的莒縣、莒南縣花生根腐病害較為嚴重；而魯中地區(qū)的寧陽縣花生莖腐病和根腐病造成了花生的大面積減產(chǎn)；膠東半島的招遠則以根腐病、白絹病為主；魯西和魯西南地區(qū)的往平、郵城和濟陽苗期主要以莖腐病為主，屮后期則以根腐病為主。2.2分離、純化出病原菌從莒縣、寧陽縣、濟陽縣、在平以及招遠等地共采集花生病株145株，利用VP3選擇性培養(yǎng)基分離病組織672塊，腐霉菌、鐮刀菌、色二砲、雜菌出現(xiàn)的頻率分別為3&1%、34.7%、21.7%和5.5%,在上述地方采集病根和病土，用黃瓜誘捕的方法分離351塊，腐霉菌、鐮刀菌、色二孑包、雜菌岀現(xiàn)的頻率分別為65.5%、8.8%、24.5%和1.2%。表1VPs培養(yǎng)基分離病原菌比例Table1TheproportionofseparatedpathogenicfungiofVP3地點塊數(shù)腐霉菌鐮刀菌色二砲其它雜菌SiteNumberPythiumFusariumDiplodiaOtherfungi莒縣1765573408寧陽226126955濟陽131252581在平79243124招遠6026925合計67225623314637 表1黃瓜誘捕法分離病原菌比例Table2TheproportionofseparatedpathogenicfungiofCucumberTrapping地點塊數(shù)腐霉菌鐮刀菌色二飽其它朵菌SiteNumberPythiumFusariumDiplodiaOtherfungi莒縣103731020寧陽776611濟陽10151941在平17170招遠53231254合計35123031864從上表1和表2可以看岀腐霉菌的出現(xiàn)頻率最高，利用水瓊脂培養(yǎng)基對疑似腐霉菌進行了純化培養(yǎng)，得到純化培養(yǎng)物。經(jīng)過病原菌形態(tài)觀察以及ITS序列測定，初步確定這些病原菌為腐霉（PW加肪7sp）。2.3病原菌的致病性測定隨機調查接菌四種不同腐霉的盆栽花生各8株，結果表明，在盆栽接菌群結）窗霉、旋柄腐霉、畸雌腐霉以及終極腐霉3天后，人部分花生衣現(xiàn)岀典型的HI間發(fā)病癥狀，對照植株則生長止常。發(fā)病率依次是畸雌腐霉〉群結腐霉〉旋柄腐霉〉終極腐霉（見表3）。通過對病變組織內病原菌的重新分離以及顯微觀察測量鑒定，新分離病菌與原接種病菌相同，表明這些腐壽菌株為花生的致病菌。表3花生致病性測定Table3Determinationofpathogenicityofpeanutplants菌株采集地接菌種類發(fā)病率病悄指數(shù)StraincollectionsitesSpeciesofinoculationMorbidityDiseaseindex寧陽P.ultimum81.82%37.66濟陽P.myriotyhun88.89%66.67招遠P.helicoides83.33%52.38莒縣P.irregulare100.00%42.86 2345678■92.4病原菌的種類鑒定結果表明：這些菌株為腐霉菌屬的群結腐霉(PythiummyriotylumDrechsler)>旋柄腐霉(PythuunhelicoidesDrechsler)>畸雌腐霉(PythiumirregulareBuisman)以及終極腐霉(PythiumultimumTrow)。試驗結果表明：4種腐霉病原菌最適生＜溫度介于25°C-30°C之間，低于5°C和高于36°C菌絲牛長緩慢；4種腐霉病原菌最適pH值介于6-7之間。2.4.1不同采集地腐霉形態(tài)學鑒定如圖圖4群結腐霉的形態(tài)Fig.4MorphologyofPythiummyriotylum1-2砲子囊3泡囊4-5泡囊破裂產(chǎn)生游動砲子6休止抱子7休止抱子萌發(fā)產(chǎn)牛芽管8-9藏卵器、雄器和卵砲了標尺=10pmPythiummyriotylumDrechsler菌落形態(tài)：菌落在CMA上無特定形態(tài)，菌絲發(fā)達,分枝，粗3.9?9.0pm。泡子囊rfl膨人與不膨人菌絲構成，膨人部分指狀或裂瓣狀，頂生或間生；游動鞄了腎形，雙鞭毛。藏卵器球形或近球形，直徑24-31.5（平均28.3）屮m平滑。頂生或間生。雄器棒狀或鉤狀，著生于分枝的雄器柄頂端，與藏卵器接觸，每個藏卵器有多個雄器，卵范子球形，直徑21-29（平均26.3）gm,平滑，不滿器，偶有滿器，壁厚1.5—2.0（平均1.76）pm,內含貯物球和折光體各一個。（圖4） 圖5旋柄腐霉的形態(tài)Fig.5MorphologyofPythiumhelicoides1-2砲子囊3胞囊層出4?6藏卵器、雄器和卵抱子標尺=10pmPythiumhelicoidesDrechsler菌落形態(tài)：菌落在CMA上呈放射狀，氣生菌絲棉絮狀。菌絲發(fā)達，粗3.5?5.2pm,分枝繁茂。陀子囊梨形、倒卵形，較少近球形,具有一乳突，頂生或間生，近球形砲子囊直徑為18.2?36.7（平均28.6）gm,梨形砲子囊為20.5?38.2|imxl9?32.5pm；抱子囊有抱囊層出現(xiàn)象，常常在抱子囊內部層出2?3層。藏卵器球形，宜徑28.6?43.2（平均37.5）pm,平滑，多數(shù)為頂生，少數(shù)切生。雄器較大，整個附著在藏卵器上，多橘瓣狀，少數(shù)棍棒狀,少數(shù)邊緣不規(guī)則，卵砲子球形，直徑22-32（平均27.8）平滑，不滿器。（圖5）PythiumirregulareBuisman菌落形態(tài):圖6畸雌腐霉的形態(tài)Fig?6MorphologyofPythiumirregulare1-2砲子囊3-7藏卵器和雄器8-9卵鞄子標尺=10pm菌落在CMA±呈放射狀，菌絲發(fā)達，不規(guī)則分枝，粗1.8?7.7|im,抱子囊梨形、檸檬形，或近球形，頂生或間生，12? 25（平均23.4）|im,藏卵器球形，多間生，偶有*頂生，15~25（平均20）pm,藏卵器壁上常有多個突起。雄器多與藏卵器同絲生，常無柄，卵砲子球形，平滑,單生偶有雙生，不滿器，11?22（平均17」）pm,內含貯物球和折光體各一個。（圖6）圖7終極腐霉的形態(tài)Fig<7MorphologyofPythiumultimum1-3菌絲膨大體4-5藏卵器和雄器6卵砲子標尺=10|imPythiumultimumTrow菌落形態(tài)：菌落在CMA上呈放射狀，菌絲發(fā)達，分枝繁茂，粗3.3?9.8pm,菌絲膨大體近球形，多間生，14?32（'卜均23.4）（im,藏卵器球形，平滑，多頂生，少間生，直徑13?30（平均20）gm,雄器多緊靠藏卵器形成，受精管明顯可見，粗約1.5gm,卵砲子球形，平滑，不滿器，10?25（平均19.2）屮m內含貯物球和折光體各一個。（圖7）2.4.2分離腐霉測序結果及同源性比較260.3PythiumrnyriofylumS39.HB-1PythiummyriofyiumGQ121316PythiumTnynotylumZ^ZY-2PythiumhelicoideslS5.ZY-3Pythiumhehcoides^l4.]AY-3PythiumuItimum94Q.JN-3Pythiumirregulare942.JX.-1Pythiumu/fj>nuzn892.JN-2PythiumheEcoides817.NY-2PythiumhehcoidesAB108052Pythiumrnyriotylum327.CP-1Pythiummyriofylum342JY?1PythiumPythiummyriofylum634UY-1PythiumirregLiiareAB107995Pythiumm^riotylum346ZY?1Pythiumhehcoides32l.ZY-4pythiumultimumAB355596250200150100500NucleotideSubstitutions(XI00)圖8分離不同地區(qū)腐霉菌株基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.8PhylogenetictreebasedonITSsequencesofPythiumcollectedfromdifferentareas在形態(tài)學鑒定的基礎上，用Blast對所分離腐霉菌株的ITS序列與GenBank中己有的 ITS序列進行比對，發(fā)現(xiàn)大部分腐霉菌株與GenBank中登記的群結腐霉(GQ121316)、旋柄腐霉(AB108052)、畸雌腐霉(AB107995)這3個腐霉種的和似性較高，都在96%以上；少數(shù)分離腐霉與終極腐霉(AB355596)的相似性雖然比較低，但遺傳距離較其他種要近。本研究未分離、鑒定到其他腐霉種類，分析其原因可能是由于地理區(qū)域不同所致。3結論與討論研究表明，腐霉是花生根部病害的主要致病菌，它能在苗期侵入，破壞植物的根部，降低植物的抗性，為其他致病菌的侵染提供侵入途徑和侵染條件，加劇其他病害的發(fā)生。其中尤以群結腐霉為重，Ganrcn(1966)和孟憲曾(1982)都曾對其有過相關的報道；而近年來有關終極腐霉和畸雌腐霉能引起根腐病的報道屢見不鮮，但在花生根腐病上還未有深入的研究；旋柄腐霉是在此次研究中發(fā)現(xiàn)的新致病腐霉，國內外至今仍未有相關的報道，其致病機理有待于進一步的研究。目前，腐霉種類的鑒定仍以形態(tài)學方法為主。分子生物學方法雖然也被廣泛應用，但只是作為一種重要的輔助工具用于形態(tài)相近或難以區(qū)分種類的鑒定。本研究采用了形態(tài)學和分子生物學相結合的方法對花生腐霉根腐病的主耍致病菌進行了鑒定，通過分離培養(yǎng)、冋接、再分離以及ITS序列比對表明，群結腐霉(PW加肋myriotylumDrechsler)、旋柄腐霉(PythiumhelicoidesDrechsler)、畸雌腐霉(PythiumirregulareBuisman)以及終極腐霉(PythiumultimumTrow)是山東花生腐霉根腐病的主要病原菌。在生產(chǎn)中我們還發(fā)現(xiàn)花生苗期死棵以及后期萎篤在山東地區(qū)發(fā)生非常普遍，造成了很人的經(jīng)濟損失，兇此如何對花生腐霉根腐病進行有效的防治將是我們今后研究的重點。參考文獻：[1]徐秀娟.中國花生病蟲草鼠害[M]?中國農(nóng)業(yè)出版社，2008,91?93.[2]Conway,K?E.SelectivemediumforisolationofPythiumspp.fromsoil[J].PlantDisease?1985,69:393?395.[3]方中達.植病研究法[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998：46?49；122?124；139；62.[4]鄭小波.疫霉菌及其研究技術[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.[5]余永年.中國真菌志[M].第六卷.霜霉/北京：科學出版社，1998：1?139.[6]馬國忠，余永年?凝膠電泳與腐霉屬的分類[J].真菌學報，1991,10(3)：217?222.