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《SN∕T 2622-2019 柑桔潰瘍病菌檢疫鑒定方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、犐犆犛０７．１００．９９?fàn)拢保担保怪腥A人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)犛犖／犜２６２２—２０１９代替ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０柑桔潰瘍病菌檢疫鑒定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻狊狌犫狊狆．犮犻狋狉犻犌犪犫狉犻犲犾犲狋犪犾．（１９８９）２０１９０９０３發(fā)布２０２００３０１實(shí)施中華人民共和國海關(guān)總署發(fā)布犛犖／犜２６２２—２０１９前言本標(biāo)準(zhǔn)按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)代替ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０《柑桔潰瘍病菌檢疫鑒定方法》，與ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０相比主要變化如下：———對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)柑桔潰瘍
2、病菌檢疫鑒定判定程序進(jìn)行了修訂；———補(bǔ)充了柑桔潰瘍病菌圖片資料；———補(bǔ)充了柑桔潰瘍病菌熒光實(shí)時(shí)ＰＣＲ檢測方法等更多可選擇的ＰＣＲ方法；———補(bǔ)充了柑桔潰瘍病菌致病性測定反應(yīng)。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國海關(guān)總署提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國成都海關(guān)、中華人民共和國上海海關(guān)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：向勇、陳玲玲、付景圓、易建平、邵寶林、何萬興、王成華。本標(biāo)準(zhǔn)代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次發(fā)布版本為：———ＳＮ／Ｔ２６２２—２０１０。Ⅰ犛犖／犜２６２２—２０１９柑桔潰瘍病菌檢疫鑒定方法１范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出境植物檢疫中柑桔潰瘍病菌的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出境蕓香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）植物及
3、其果實(shí)中柑桔潰瘍病菌的檢疫鑒定。２規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法ＳＮ／Ｔ１１５７進(jìn)出境植物苗木檢疫規(guī)程ＳＮ／Ｔ２１２２進(jìn)出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣３病菌的基本信息柑桔潰瘍病菌犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊犮犻狋狉犻ｓｕｂｓｐ．犮犻狋狉犻Ｇａｂｒｉｅｌ犲狋犪犾．（１９８９），屬細(xì)菌域Ｂａｃｔｅｒｉａ，變形菌門Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，γ變形細(xì)菌綱Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，黃單胞菌目Ｘａｎｔｈ
4、ｏｍｏｎａｄａｌｅｓ，黃單胞桿菌科Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，黃單胞菌屬犡犪狀狋犺狅犿狅狀犪狊，該病菌的其它信息參見附錄Ａ。４方法原理該病菌的為害癥狀、菌落形態(tài)特性、致病性反應(yīng)、ＰＣＲ特異性反應(yīng)是其檢疫鑒定的主要依據(jù)。５主要試劑除另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)中試劑均為分析純或生化試劑，試驗(yàn)用水參照ＧＢ／Ｔ６６８２。７０％乙醇、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、瓊脂、溴化乙錠（ＥＢ）、瓊脂糖、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ體系、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＴａｑＭａｎ探針等。６儀器設(shè)備體式顯微鏡、超掙工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、生物培養(yǎng)箱、電子天平、普通冰箱、超低溫冰箱、離心機(jī)、渦旋混勻
5、儀、純水儀、濁度計(jì)、ＰＣＲ儀、實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、微量可調(diào)加樣器、剪刀、培養(yǎng)皿、三角瓶。７檢疫鑒定７．１檢疫鑒定流程柑桔潰瘍病菌鑒定流程如圖１所示。１犛犖／犜２６２２—２０１９圖１柑桔潰瘍病菌鑒定流程７．２癥狀檢查按照ＳＮ／Ｔ１１５７和ＳＮ／Ｔ２１２２中規(guī)定的程序進(jìn)行現(xiàn)場檢疫并抽取樣品。實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品進(jìn)行癥狀檢查，觀察待檢樣品是否帶有疑似癥狀（參見附錄Ａ），如有癥狀，切取癥狀處組織在顯微鏡下觀察是否有噴菌現(xiàn)象，如有噴菌，直接從噴菌組織分離病菌。如樣品無癥或有癥樣品未見噴菌，進(jìn)行ＰＣＲ初檢，ＰＣＲ方法見附錄Ｂ。ＰＣＲ結(jié)果為陽性的樣品再進(jìn)行病菌分離。７．３犘犆犚檢測
6、取無癥樣品或未見噴菌的有癥樣品，滅菌生理鹽水室溫浸泡處理３０ｍｉｎ或４℃冰箱過夜，震蕩，取浸泡液１００００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，沉淀提取ＤＮＡ。常規(guī)ＰＣＲ或?qū)崟r(shí)熒光ＰＣＲ檢測（附錄Ｂ），柑桔潰瘍病菌ＤＮＡ作為陽性對(duì)照，非柑桔潰瘍病菌ＤＮＡ作為陰性對(duì)照，雙蒸水作為空白對(duì)照。７．４病菌分離有癥樣品癥狀處切?。玻恚怼粒玻恚硇K組織，制片后于顯微鏡１０×～２０×倍下觀察切口處是否有云霧狀細(xì)菌從切口處噴出。每個(gè)樣品切取５～１０個(gè)小塊組織觀察噴菌，分離其中有噴菌的３～５個(gè)小２犛犖／犜２６２２—２０１９塊組織，如不足３個(gè)噴菌組織，可增加鏡檢的組織數(shù)量。如有噴菌，將噴菌組織塊取出，無菌水沖洗
7、一次，７０％酒精表面消毒處理３０ｓ～６０ｓ，無菌水沖洗三次，轉(zhuǎn)入１００μＬ無菌水中浸泡１５ｍｉｎ；處理液于ＮＡ平板上劃線分離，每個(gè)處理劃線３個(gè)～５個(gè)平板；２８℃培養(yǎng)２ｄ～４ｄ后觀察是否有典型菌落。疑似菌落純化三次后進(jìn)行下一步鑒定試驗(yàn)。如有癥樣品未觀察到噴菌現(xiàn)象，取癥狀處組織剪刀剪成２ｍｍ見方小塊，加入適量滅菌水中室溫浸泡３０ｍｉｎ或４℃冰箱過夜，取一半處理液１００００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，沉淀提?。模危粒Ｒ?guī)ＰＣＲ或?qū)崟r(shí)熒光ＰＣＲ初檢。陽性樣品處理液稀釋１０×、１００×和１０
