[精品]海馬鑒定

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1、神經(jīng)元鑒定采用神經(jīng)元特界性烯醇化酶(NSE)免疫紐.織化學方法(LSAB法?標記式鏈霉親和素■生物素免疫組織化學方法)對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元進行鑒定。取出培養(yǎng)8天的神經(jīng)細胞，吸掉培養(yǎng)液用溫(37°C)0.1mol/LPBS(pH7.4)洗2遍，4%多聚甲醛固定3()分鐘，再用PBS輕洗兩遍，風干備染。固定后的細胞用().()1mol/LPBST(pH7.4)浸洗5分鐘,3次;用0.3%H2O2的80%T醇溶液氧化10分鐘;流水洗5分鐘;PBST洗5分釗J3次;滴加阻斷液止常山羊血清30分鐘;滴加一抗(神經(jīng)元特異性希醇化酶，NSE鼠抗

2、人單抗)125,4°C過枚，陰性對照用PBS代替一抗;PBST洗5分鐘，3次;滴加二抗(羊抗小鼠)室溫90分鐘;PBST洗5分鐘3次;滴加鏈霉卵口素HRP復合物室溫90分鐘;PBST洗5分鐘3次;0.05%DAB?0.03%H202顯色液，顯色5?10分鐘;流水洗，廿油明膠封片，光鏡下觀察。NSE免疫組化染色結(jié)果NSE免疫組織化學染色顯示：NSE免疫反應物呈棕黃色，顆粒狀，陽性反應顆粒主要分布于神經(jīng)細胞的胞漿及較粗大的突起屮，神經(jīng)膠質(zhì)細胞不著色，陰性對照未見細胞著色。培養(yǎng)8天的神經(jīng)細胞均勻地分散于膠質(zhì)細胞上面，胞休呈鬪形或者多邊

3、形，伸出較長的突起，神經(jīng)細胞生長良好，發(fā)育成熟，可以進行實驗研究培養(yǎng)結(jié)果倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)大鼠海馬神經(jīng)細胞于倒置相差顯微鏡下觀察：接種的神經(jīng)細胞最初呈圓形;接種1?2小時兒乎全部帖附于多聚賴氨酸處理過的小蓋玻片和培養(yǎng)板壁。此時細胞分散，呈現(xiàn)強折光的胞體，核不可見。培養(yǎng)第二天大部分細胞已經(jīng)伸出突起，胞體飽滿，光暈明顯，膠質(zhì)細胞很少見。第三天神經(jīng)細胞突起更長，胞體逐漸變大,并可見少量膠質(zhì)細胞;第4?6天神經(jīng)細胞突起均已連接成神經(jīng)網(wǎng)絡，呈絲帶狀。培養(yǎng)7?8天，細胞胞休飽滿，呈圓形、梭形、三角形或者多邊形

4、，細胞核大而鬪，位于胞體中央或者偏于一側(cè)，核仁清晰可見，經(jīng)胞體伸出大量突起并和互連接成神經(jīng)網(wǎng)絡，此時神經(jīng)細胞已經(jīng)發(fā)育成熟神經(jīng)細胞NSE染色抗血清的SABC法染色取培養(yǎng)6天的6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進行神經(jīng)元特界的烯醇化酶（neuron-specificenolase,NSE）抗體染色和抗神經(jīng)微絲單克隆抗體一SMI-32mAb免疫組織化學染色：棄去培養(yǎng)液，0.01MPBS清洗3次，每次5分鐘;4%多聚甲醛室溫固定1小時；0.01MPBS清洗3次，每次5分鐘；加入0.3%H2O2甲醇，作用10分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化氫酶；0.01MPB

5、S清洗3次，每次5分鐘后；移到37°C濕盒，將10%綿羊血清滴加在蓋玻片上，每孔3~4滴，放入37°C溫箱孵育20分鐘；吸去封閉液，勿洗，加入一抗（1：200兔抗鼠NSE抗體或仁2000鼠SMI-32mAb）,每片加3?4滴，4°C冰箱過夜；0.01MPBS清洗3次，每次5分鐘；將二抗（1：200生物素化的山羊抗兔或羊抗鼠IgG）滴加在蓋玻片上，每孔3?4滴，放入37°C溫箱孵育60分鐘；0.01MPBS清洗3次，每次5分鐘；即用型ABC液滴加在蓋玻片上，放入37°C溫箱中孵育60分鐘；0.01MPBS清洗3次，每次5分鐘；滴加

6、DAB顯色液作用3?10分鐘，顯微鏡下控制；酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。四川航嘉生物醫(yī)藥科技有限責任公司多聚甲醛價格每瓶12元發(fā)貨期7天武漢博士徳生物工程有限公司正常山羊血清（封閉）每瓶10元（即用型）上海達豪生物科技冇限公司NSE/神經(jīng)元特界性稀醇化酶上海江萊生物科技有限公司羊抗大鼠IgG上海雙螺旋生物科技有限公司PBST價格：40元/罐產(chǎn)地：上海北京賽馳生物科技冇限公司DAB染色試劑盒待海馬神經(jīng)元發(fā)育成熟后(約14d后)，取出爬片，選擇NSE作為海馬袖經(jīng)元的標志物，按標準的免疫細胞化學染色SP法進行鑒定。方法如下：①取出

7、的爬片用0.01%PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定40min,PBS浸洗5min；②3%H2O2孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；③滴加試劑A進行封閉亨室溫約15min,吸去，勿洗；④加入I抗(NSEJ:50)MC過夜JBS沖洗3minX3次;⑤滴加n抗，室溫15?20min,PBS沖洗3min,3次；⑥滴加試劑C,室溫15min,PBS沖洗3minX3次；⑦DAB顯色試劑盒顯色3?5min,PBS沖洗3minX3次。最后經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，鏡下觀察,攝片。以PBS(0.01mol?Li)緩沖液代替1抗

8、作陰性對照。