[精品]菌種鑒定

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1、細(xì)菌基因組的提取:1快速微量提収法A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心lmin,丟去上清夜，收集菌體。B.加入400ul裂解液(40mMTris■醋酸，20mM醋酸鈉,lmMEDTA,l%SDS,pH7.8)混勻，置于37°C水浴lhr0C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000gm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積酷酸鉀(3M,pH8.0),?20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min,棄上清液，沉淀

2、用70%乙醇洗2次;置于室溫干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4°C保存?zhèn)溆谩?蛋口酶/SDS法制備先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftiasp.,第二天4000rpm離心lOmin收集菌體，用WashingTE(50mmol/LTris-HClpH8.0,1Ommol/LEDTApH&0)洗菌體2次，Z后將菌體充分懸浮在5mllxTE緩沖液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS,輕輕混勻后50°C放置3h?5h,接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯

3、仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA,用自動(dòng)移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)lxTE或ddH20中。3⑴細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種于5ml液休培養(yǎng)基中，37°C搖床(300rpm)培養(yǎng)過液。⑵細(xì)菌收集：取lml培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，室溫SOOOrpm心5mim棄上清，沉淀重新懸浮于lmlTE(pH8.0)中(用ddH20也行)。⑶菌體裂解：加入6

4、il50mg/m1的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaC150pl,10%SDSllOpl,20mg/m1的蛋白酶K3pl,50°

5、C作用3h或37°C過後。(此時(shí)菌液應(yīng)為透明粘稠液體)(4)抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5mlEP管，加等體積的酚：氯仿：界戊醇(25:24:1),混勻，室溫放置5-10mino12000rpm離心lOmino抽提兩次。(上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去)⑸沉淀：加0.6倍體積的異內(nèi)醇，混勻，室溫放置lOmino12000rpm離心lOmino(6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。(7)抽(涼)干后，溶于50plddH2O中，収2?5山電泳。作PCR模板用。4DNAEXTRACTIONPROCEDURE?GENERAL

6、1)Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2)Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH8.0),50mMEDTA.3)Freezecellsuspensionat-20C4)Add0.5ml250mMTris(pH8.0),10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature?Whenthawed,placeonicefor45min.5)Add1

7、ml0.5%SDS,50mMTris(pH7.5),0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.6)Extractwith6mlTris-cquilibratcdphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transfertoplayertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessary.7)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol

8、95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8)Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.Transfertoplayertoanewtube?9)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),

9、thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10)SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA.11)CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricana