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1、銅鋅SOD的分離純化與活性鑒定【實(shí)驗導(dǎo)讀】蛋口質(zhì)的提取分離技術(shù)是化學(xué)牛物序研究者應(yīng)該熟練掌握的重點(diǎn)技術(shù)之一。蛋白質(zhì)的純化步驟應(yīng)根據(jù)純化蛋白的具體性質(zhì)來設(shè)計?？梢岳玫降男再|(zhì)包括蛋白質(zhì)的分了量人小、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、對冇機(jī)溶劑的耐受性、對溫度的耐受性、中性無機(jī)鹽對蛋白質(zhì)溶解性的影響等等。為了保證蛋白質(zhì)提取分離純化的成功，需耍在整個實(shí)驗過程中，對所得蛋白質(zhì)的總量和活性進(jìn)行不斷監(jiān)測。SOD是超氧化物歧化酶的簡稱，是一個典型的腮類蛋白質(zhì)。它催化超氧化物的歧化反應(yīng)，是真核生物細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的重耍組成部分。它能夠耐受相對較高的溫度、對有機(jī)溶劑丙酮和氯仿-乙醇也具有較好的耐受性。利用這些
2、性質(zhì)，木實(shí)驗通過一些列實(shí)驗流程達(dá)到了對大蒜SOD進(jìn)行初步純化的目的。每經(jīng)過一個純化步驟，本實(shí)驗都將監(jiān)測所得產(chǎn)物的總蛋白量以及總SOD活性，并計算SODiW在總蛋白屮的比活力(總SOD活性與總蛋白量之比)。如果分離純化過程是成功的，則總蛋白量應(yīng)不斷下降，而SOD酶的比活力應(yīng)不斷上升。通過本實(shí)驗的訓(xùn)練，讀者應(yīng)該能夠初步掌握蛋口質(zhì)的純化流程，根據(jù)所給蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)設(shè)計出一?套比較合理的蛋口質(zhì)純化方案。一、實(shí)驗?zāi)康?.進(jìn)一步熟悉掌握分光光度計的使用方.2.熟悉SOD提収與分離的基本原理與操作方法，學(xué)習(xí)一般蛋白質(zhì)純化的基本流程.3.掌握考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋口質(zhì)含量的基本原理與操作
3、.4.了解SOD活力測定一鄰苯三酚法的原理.二、基本原理對于以氧氣作為呼吸作用最終電子受體的生物來說，除將氧氣還原為其完全還原產(chǎn)物水以外，還有可能產(chǎn)牛包括超氧負(fù)離子(0Q在內(nèi)的一系列不完全還原產(chǎn)物，這類分子統(tǒng)稱為活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)。ROS具有極強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性，「】J以與蛋白質(zhì)、脂類、核酸等生物人分了發(fā)生反應(yīng)并破壞它們的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。ROS在細(xì)胞內(nèi)聚集將對細(xì)胞的正常住命活動造成不良后果。為了應(yīng)對這一潛在的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，細(xì)胞內(nèi)形成了一套有效的ROS清除系統(tǒng)。超氧化物歧化K(superoxidedismutase,SOD)是細(xì)胞內(nèi)RO
4、S清除系統(tǒng)的重要組分Z-oSOD廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，可催化細(xì)胞內(nèi)超氧負(fù)離了(01)的歧化反應(yīng)，將02轉(zhuǎn)化為山02和0“因此，SOD具有強(qiáng)烈的抗氧化活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用両景。本實(shí)驗介紹的是一種SOD初步純化方法。SOD是一種多聚體金屬蛋白，根據(jù)酶活性中心所盂金屬輔某的不同，可將SOD進(jìn)一步分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-S0D4種，這四種不同的SOD分別由不同的基因編碼。無論是在原核還是真核牛?物當(dāng)中，SOD基因的表達(dá)都處于體內(nèi)外各種因素的嚴(yán)密調(diào)控之下。原核生物SOD基因的表達(dá)調(diào)控主要受其生長營養(yǎng)條件以及所處壞
5、境的影響。而在真核生物細(xì)胞內(nèi)，SOD基因的表達(dá)調(diào)控則與動植物的生長發(fā)冇階段與體內(nèi)各種激素水平有關(guān)⑷。Cu/Zn-SOD主要存在于真核住物與細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)菌、植物和動物屮，Cu/Zn-SOD的編碼基因序列保守性較低，這可能與不同生物適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制不盡相同有XoMn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中。FeSOD存在于原核生物和少數(shù)植物中，在原核生物和植物葉綠體屮編碼l^e-SOD的基因序列相似性很高⑵。Ni-SOD的發(fā)現(xiàn)則相對較晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚沒有被發(fā)現(xiàn)⑶。天然存在的這些SOD,雖然活性屮心所需的金屬離子不同，但催化活性部位卻具有高度的
6、結(jié)構(gòu)同一性和進(jìn)化的保守性。即活性小心金屬離子都是與3到4個組氨酸(His)殘基的咪喘基(血-SOD含1個天門冬氨酸竣基配位)呈畸變的四方錐或扭曲的四面體配位。三種SOD的主要性質(zhì)比較見下表。三種SOD的主要理化性質(zhì)比較Cu/Zn-SODMn-SODFe-SOD分子結(jié)構(gòu)一或四聚體一或四聚體一或四聚體分子量32000,6500042000,8500042000,85000每個亞棊金屬含量1Cu:1Zn0.5~lMn0.5~lFe顏色藍(lán)綠色紫紅色黃褐色特征吸收峰260nm,680nm280nm,475nm280nm分子構(gòu)象主要為B-折疊主要為?-螺旋主要為a-螺旋抑制劑CN、II
7、202氯仿-乙醇氯仿■乙醇、H202Cu/Zn-SOD是分布最廣而且是最重要的SOD,主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)，分子量約為32KD,通常情況下由兩個亞基組成。Cu/Zn-SOD對熱、pH以及某些比較極端的理化因素具有有較強(qiáng)的耐受性。比如，即使經(jīng)60°C短時間處理后酶的活性幾乎無損失；同時，酶活性不受冇機(jī)溶劑乙醇和氯仿影響。大蒜蒜瓣內(nèi)含冇較豐富的Cu/ZnSOD,通過組織破碎后,可溶解于PH7.8磷酸緩沖液中。由于該酚不溶于丙酮,可用丙酮將其沉淀析IIIoCu/Zn-SOD對氯仿-乙醇混合液不敏感，即使用這種混合
