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《內(nèi)源脫落酸實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、一、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料新鮮植物材料2.儀器設(shè)備研缽，冷凍離心機(jī)，氮?dú)獯蹈裳b置，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，吸水紙，恒溫箱，冰箱，96孔酶標(biāo)板，可調(diào)微量液體加樣器(10UL,40PL,200UL,1000uL),帶蓋瓷盤(內(nèi)鋪濕紗布)。3?試劑(1)包被緩沖液:稱取1.5gNa2CO3,2.93gNaHCO3,0.2gNaN3(可不加)，用量筒加1000mL蒸憎水，pH為9.6。(2)磷酸鹽緩PP液(PBS)：稱取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4?12H2O,用量筒加
2、1000mL蒸憾水,pH為7.5。(3)樣品稀釋液:500mLPBS屮加0.5mLTween-20,0.5g明膠(稍加熱溶解)。(4)底物緩沖液:稱HZ5.10gC6H8O7-H2O(檸檬酸),18.43gNa2HPO4-12H2O,用量筒加1000mL蒸憎水溶解,再加1mLTween-20,pH為5.0。(5)洗滌液：lOOOmLPBS加1mLTween?20。⑹終止液：2mol/L硫酸。(7)提取液：80%甲醇，內(nèi)含1mmol/LBHT(二叔丁基對(duì)甲苯酚為抗氧化劑，先用100%甲醇溶解BHT
3、,再配成80%的濃度。否則BHT難溶解)。(8)各激素包被抗原、各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(間接和簡(jiǎn)化I'可接酶免疫測(cè)定用試劑)。各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和各激素酶標(biāo)物(直接酶免疫測(cè)定用試劑)。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品中激素的提取(1)稱取0.5-1.0g新鮮植物材料(若取樣后材料不能馬上測(cè)定，用液氮速凍后保存在-20°C的低溫冰箱屮)，加2mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10mL試管，再用2mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4°C冰箱中
4、。⑵4°C下提取4h,1000g離心15min(實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)型號(hào)LDZ5-2,約4000rpm),取上清液。沉淀中加1mL提取液，攪勻，置4°C下再提取1h,離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢ァ＂巧锨逡哼^(guò)CJ8固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇(1mL)平衡柱一上樣一收集樣品一移開樣品后用100%甲醇(5mL)洗柱-100%乙噬(5mL)洗柱一100%甲醇(5mL)洗柱一循環(huán)。(4)將過(guò)柱后的樣品轉(zhuǎn)入5mL塑料離心管中，真空濃縮干燥或用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定?一般0.5
5、g鮮重用1.5-3.0mL左右樣品稀釋液定容)。2.樣品測(cè)定(I)包被：在10mL包被緩沖液中加入一定量的包被抗原(最適稀釋倍數(shù)見(jiàn)試劑盒標(biāo)簽),一、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.材料新鮮植物材料2.儀器設(shè)備研缽，冷凍離心機(jī)，氮?dú)獯蹈裳b置，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，吸水紙，恒溫箱，冰箱，96孔酶標(biāo)板，可調(diào)微量液體加樣器(10UL,40PL,200UL,1000uL),帶蓋瓷盤(內(nèi)鋪濕紗布)。3?試劑(1)包被緩沖液:稱取1.5gNa2CO3,2.93gNaHCO3,0.2gNaN3(可不加)，用量筒加1000mL
6、蒸憎水，pH為9.6。(2)磷酸鹽緩PP液(PBS)：稱取8.0gNaCl,0.2gKH2PO4,2.96gNa2HPO4?12H2O,用量筒加1000mL蒸憾水,pH為7.5。(3)樣品稀釋液:500mLPBS屮加0.5mLTween-20,0.5g明膠(稍加熱溶解)。(4)底物緩沖液:稱HZ5.10gC6H8O7-H2O(檸檬酸),18.43gNa2HPO4-12H2O,用量筒加1000mL蒸憎水溶解,再加1mLTween-20,pH為5.0。(5)洗滌液：lOOOmLPBS加1mLTwee
7、n?20。⑹終止液：2mol/L硫酸。(7)提取液：80%甲醇，內(nèi)含1mmol/LBHT(二叔丁基對(duì)甲苯酚為抗氧化劑，先用100%甲醇溶解BHT,再配成80%的濃度。否則BHT難溶解)。(8)各激素包被抗原、各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(間接和簡(jiǎn)化I'可接酶免疫測(cè)定用試劑)。各激素抗體、激素標(biāo)準(zhǔn)物和各激素酶標(biāo)物(直接酶免疫測(cè)定用試劑)。二、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品中激素的提取(1)稱取0.5-1.0g新鮮植物材料(若取樣后材料不能馬上測(cè)定，用液氮速凍后保存在-20°C的低溫
8、冰箱屮)，加2mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10mL試管，再用2mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4°C冰箱中。⑵4°C下提取4h,1000g離心15min(實(shí)驗(yàn)中離心機(jī)型號(hào)LDZ5-2,約4000rpm),取上清液。沉淀中加1mL提取液，攪勻，置4°C下再提取1h,離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)鼦壢?。⑶上清液過(guò)CJ8固相萃取柱。具體步驟是：80%甲醇(1mL)平衡柱一上樣一收集樣品一移開樣品后用100%甲醇(5mL)洗柱-100%乙噬(5mL)洗柱一100%
