產(chǎn)高效細(xì)菌素乳酸菌的篩選及鑒定

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1、產(chǎn)高效細(xì)茵索乳酸茵的篩選及鑒左摘要：本研究旨在從口然生境中篩選產(chǎn)高效抑菌蛋白的乳酸菌，并進(jìn)行抑菌活性分析和菌種鑒定。通過牛津杯法抑菌試驗對樣木屮乳酸菌進(jìn)行初篩，然后對發(fā)酵液進(jìn)行排除酸、過氧化氫干擾和蛋口酶處理，進(jìn)一步復(fù)篩出產(chǎn)抑菌蛋口的乳酸菌。通過形態(tài)學(xué)、生理生化、糖發(fā)酵(API)和16SrDNA基因序列同源性分析進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果表明:本研究成功地篩選出2株対金黃色衙萄球菌、單增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用的乳酸菌(抑菌圈直徑均＞20mm),證明其抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)并推測為細(xì)菌索，菌種鑒定為植物乳桿菌和糞腸球菌。本試驗對高效細(xì)菌素一乳酸菌的研究為食殆及飼料

2、行業(yè)中乳酸菌素的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。關(guān)鍵詞：乳酸菌；細(xì)菌素；篩選鑒定；抑菌活性畜牧牛產(chǎn)中抗牛:素濫用、病源微牛物耐藥性等問題嚴(yán)重威脅著食品安全及人類健康，越來越多的研究致力于尋找新型安全有?效的綠色飼料添加劑作為理想的抗牛素替代品。細(xì)菌素是細(xì)菌在牛?長過程中通過核糖體途徑合成并分泌到壞境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物質(zhì)，具有高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗商性等優(yōu)點[1]。目前國內(nèi)外対細(xì)菌素的研究主耍集中在芽他桿菌和乳酸菌上，乳酸菌是一類可發(fā)酵碳水化合物、產(chǎn)生人量乳酸050%)的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統(tǒng)稱⑵o飼料中添加乳酸菌制劑町以促進(jìn)動物胃腸道微牛態(tài)平衡，改

3、善動物健康[3]O我國《飼料添加劑品種目錄(2010)》中允許添加的29種微牛:物菌種中有9種屬于乳酸菌屬。添加植物乳桿菌的發(fā)酵飼料中粗蛋口、粗脂肪含量明顯上升，提高飼料利用率[4]oRiboulet等[5]研究表明，乳桿菌素Abpll8對小鼠和豬的腸道沙門氏菌等致病菌有顯著的抑制作用并彫響動物機(jī)體免疫力。因此對乳酸菌細(xì)菌素抑菌能力的挖掘成為開發(fā)綠色飼料添加劑的重點。木試驗旨在篩選出對病原菌冇高效、廣譜抑菌活性的產(chǎn)細(xì)菌索乳酸菌菌株，并對其進(jìn)行菌株鑒定，為天然女全的飼料添加劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑生境材料(酸菜、生牛奶、青貯料、土壤等)

4、；指示菌為單增李斯特菌(L.monocytogenescvccl599)；金黃色葡萄球菌(S.aureuscvcc26003)；藤黃八疊微球菌(S.luteacmcc28001)；大腸桿菌(E.coilcvcc245)；沙門氏菌(S.typhimuriumcvcc541)；培養(yǎng)基(MRS、BPY、LB等)，藥詁采用國產(chǎn)分析純；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根主化有限公司)；AnalyticProductsINCAPI50CH試劑盒(法國梅里埃)。16SrDNA的PCR擴(kuò)增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1525R：5’-A

5、GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。1.2產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的初篩乳酸菌的分離與培養(yǎng)：將收集的樣本懸浮于無菌牛理鹽水屮按梯度稀釋,涂布于含漠甲酚紫指示劑(0.01%)的MRS瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,挑選培養(yǎng)基變黃的菌落劃線純化，選取鏡檢革蘭氏染色陽性、無芽孑包的菌株于MRS液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h作為種子液。種子液按2%接種于新的MRS液體培養(yǎng)基37°C靜置培養(yǎng)36h作為發(fā)酵液。以8000r/min離心10min,取上清液備用。指示菌的制備：選取的4株指示菌中大腸桿菌用LB培養(yǎng)基，其余用BPY培養(yǎng)基，種子液按2%接種于液體培養(yǎng)基37

6、6C>150r/min搖床過夜(濃度約達(dá)109個/mL),稀釋到107CFU/mL備用。菌株抑菌試驗初篩：采用牛津杯法。取備用指示菌(107CFU/mL)150uL涂布于BPY瓊脂平板上,放置3個牛津杯/板，常溫干燥30mine取菌株發(fā)酵上清200uL加入牛津杯內(nèi)，以空口培養(yǎng)基為對照，3個重復(fù)/樣，置于37°C培養(yǎng)24h,測定抑菌圈直徑d(mm)。選取抑菌效杲較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，用甘汕-20€保種備用。1.3產(chǎn)抑菌蛋白乳酸菌的復(fù)篩同上制作初篩菌株的發(fā)酵液和指示菌液。檢測各菌株發(fā)酵上清液的pH值，并對發(fā)酵上清進(jìn)行排酸、過氧化氫酶和蛋白酶處理：①上清原液；②用Na

7、OH調(diào)節(jié)上清至pH5.5；③調(diào)節(jié)上清至pH7.2并用過氧化氫酶、蛋白酶(lmg/mL)處理，37°C溫育2h后調(diào)回岡至5.5[6]:④對照：用乳酸、乙酸調(diào)節(jié)pH為4.0的培養(yǎng)基。牛津杯法測抑菌活性。選用單增李斯特菌、藤黃八疊微球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌作為指示菌，牛津杯法測定各菌株發(fā)酵上清抑菌活性，分析各菌株抑菌效果并篩選出含有高效抑菌蛋口的乳酸菌作為目標(biāo)菌株。1.4菌株的鑒定形態(tài)學(xué)鑒定：將F1標(biāo)菌株劃線于MRS瓊脂平板，37°C培養(yǎng)48h,觀察菌落形態(tài)，挑収單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。生理生化鑒定：對菌株進(jìn)行接觸酶、硝酸還原、產(chǎn)氨、水解、H2S、

8、VP、呵喙、明膠液化等試驗（參照《乳酸