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《關(guān)于人-鼠嵌合抗體制備可行性》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、關(guān)于人-鼠嵌合抗體制備的可行性一、概述人-鼠嵌合抗體，即抗體的可變區(qū)來自鼠單克隆抗體，而恒定區(qū)則來自人的抗體。它是通過從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。嵌合抗體既保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力，又大大減少了鼠源性在人體內(nèi)的免疫原性，其半衰期明顯延長，且在介導(dǎo)CDC及ADCC方面亦明顯增強。二、市場分析附表是中國SFDA批準(zhǔn)上市和進(jìn)入臨床的治療型單抗藥物..抗體名稱廠家靶抗原抗體類型適應(yīng)癥研發(fā)階段Muromonab-CD3強生CD-3鼠源抗移
2、植排斥批準(zhǔn)上市Rituximab羅氏CD-20嵌合B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤批準(zhǔn)上市Trastuzumab羅氏HER-2人源化乳腺癌批準(zhǔn)上市Basiliximab諾華CD-25嵌合抗移植排斥批準(zhǔn)上市Trastuzumab基因泰克HER-2人源化乳腺癌批準(zhǔn)上市OKT3武漢生物制品研究所CD-3鼠源抗移植排斥批準(zhǔn)上市抗人IL-8單克隆抗體乳膏東莞宏遠(yuǎn)逸士生物公司IL-8鼠源銀屑病批準(zhǔn)上市重組人源化抗人表皮因子受體單克隆抗體注射液百泰生物藥業(yè)公司人表皮因子受體人源化上皮源性腫瘤批準(zhǔn)上市碘［131I］美妥昔單抗注射成都華神
3、集團，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源肝癌批準(zhǔn)上市碘［131I］人鼠嵌合型腫瘤細(xì)胞核單克隆抗體注射液上海美恩生物技術(shù)公司嵌合抗腫瘤批準(zhǔn)上市重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體－抗體融合蛋白上海中信國健藥業(yè)公司腫瘤壞死因子人源化銀屑病和強直性脊柱炎批準(zhǔn)上市鼠抗人T淋巴細(xì)胞CD3表面抗原單克隆抗體濟南天康生物制品公司CD-3鼠源抗移植排斥臨床研究注射用抗腎病綜合癥出血熱病毒單克隆抗體（I型）武漢生物制品所，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源出血熱臨床Ⅲ期抗人肝癌單抗Hepama?1中科院細(xì)胞所鼠源肝癌臨床研究抗乙型腦炎單抗北京生物制品所，第四軍醫(yī)大學(xué)鼠源乙
4、型腦炎臨床研究注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白上海美恩生物公司嵌合腫瘤臨床研究目前國內(nèi)上市的單抗藥物有11個，其中5個是國外進(jìn)口產(chǎn)品，我國上市的自行開發(fā)的治療性單抗藥物的有6個，處于臨床研究階段的有5個(表6)。其中，武漢生物制品研究所抗腎移植單抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴細(xì)胞CD3抗原單克隆抗體），也是最早批準(zhǔn)上市的國內(nèi)自行研制的抗體，具有免疫抑制作用，可逆轉(zhuǎn)對移植器官的排斥反應(yīng)；由北京百泰生物藥業(yè)有限公司與古巴合作開發(fā)的I類癌癥治療新藥“重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體”（商品
5、名：泰欣生）于2005年4月11日獲得國家I類新藥證書。這是我國批準(zhǔn)的第一個人源化單克隆抗體藥物，它的問世標(biāo)志著我國在癌癥靶向治療和人源化抗體藥物領(lǐng)域取得重大突破，該藥主要用于治療頭頸部、食管、肺部、乳腺、結(jié)直腸等部位的上皮源性腫瘤；由第四軍醫(yī)大學(xué)、成都華神集團股份有限公司聯(lián)合研制的碘［131Ｉ］美妥昔單抗注射液（商品名：利卡?。?005年4月20日獲得國家I類新藥證書。這是全球第一個用于治療原發(fā)性肝癌的藥物，也是我國第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗體類藥物。..一、應(yīng)用嵌合抗體目前主要用于藥物治療方面，與鼠抗
6、相比，嵌合抗體既保留了鼠源可變的高親和性，又具有人Fc段的多種免疫殺傷功能，從而大大降低了人抗鼠抗體反應(yīng)的發(fā)生幾率，改善了臨床治療效果，與其它小分子基因工程抗體相比，嵌合抗體作為完成的抗體分子，在體內(nèi)半壽期更長，并具有人Fc段的多種免疫殺傷功能。?二、技術(shù)路線從雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA擴增輕鏈、重鏈的V區(qū)基因插入含信號肽及人Ig重鏈、輕鏈C區(qū)基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞克隆、測序分析制備腹水生產(chǎn)抗體檢測抗體特異性與人源性酶切鑒定、測序分析三、材料與儀器1．材料大腸桿菌DH5α，大腸桿
7、菌感受態(tài)細(xì)胞，T-A克隆載體T-EasyVector，含信號肽及重鏈、輕鏈恒定區(qū)基因的質(zhì)粒pAc-κ-CH3，分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞，真核表達(dá)載體pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0。..1．主要試劑氨芐西林鈉，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，TaqDNA酶，TrizolRNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，瓊脂糖，嗅化乙錠(EB)，dNTPs，DNAMarker，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，胎牛血清，無血清培養(yǎng)液，二甲亞砜(DMSO)，轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000，MTX，
8、抗原，羊抗人IgGFc片段-HRP酶標(biāo)抗體。2．主要儀器低溫高速臺式離心機，恒溫?fù)u床，恒溫水浴箱，水平式電泳儀，PCR擴增儀，紫外分光光度計，紫外透射儀，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，潔凈工作臺，酶標(biāo)儀。一、關(guān)鍵技術(shù)與方法1．可變區(qū)基因克隆1.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞株約107個細(xì)胞，按照TrizolRNA提取試劑盒的說明書抽提細(xì)胞的總RNA，再進(jìn)行RT-PCR擴增，回收純化擴增產(chǎn)
