實(shí)驗(yàn)總結(jié)-Western blot

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1、WesternBlotWesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)WB-蛋白提

2、取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采

3、用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（PMSF）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)

4、點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/l濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變

5、性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。一、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?.倒掉培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液2.每皿細(xì)胞加1ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3.按1ml裂解液加10μPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4.每皿細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上

6、裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)皿要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5.裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6.于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于-20℃保存。二、組織中總蛋白的提?。?.將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2.加400μ單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3.幾分鐘后再

7、碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4.裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。三、加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊懀恍┘?xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?.將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2.棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS

8、重復(fù)洗滌一次。3.用槍洗干上清后，加100μ裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃.12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。（可在蛋白濃度測(cè)定結(jié)束后用SDS稀釋蛋白后再保存）WB-BCA蛋白含量測(cè)定一、原理：BCA(bicinchoninincacid)與二價(jià)銅離子