α-淀粉酶的研究及應(yīng)用文獻(xiàn)綜述

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1、文獻(xiàn)綜述α-淀粉酶的研究及應(yīng)用淀粉酶是一種水解酶，是目前發(fā)酵工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的一類酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。根據(jù)作用的方式可分為α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）與β-淀粉酶（EC3.2.1.2.）。因α-淀粉酶作用于淀粉時(shí)從淀粉分子的內(nèi)部隨機(jī)切開α-1,4糖苷鍵，生成糊精和還原糖，而β-淀粉酶從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷α-1,4-葡聚糖鏈生成分子量比較大的極限糊精，且α-淀粉酶分布更廣泛，已是一種十分重要的酶制劑，α-淀粉酶大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)

2、、釀造、發(fā)酵、和醫(yī)藥行業(yè)等，它占了整個(gè)酶制劑市場份額的25%左右[1]。目前工業(yè)生產(chǎn)上都以微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶。但隨著社會(huì)需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對(duì)α-淀粉酶的需求量也越來越大，急需尋找滿足生產(chǎn)需要的具新型特征的酶制劑。因此本文主要討論以α-淀粉酶為代表的淀粉酶的研究及應(yīng)用。1α-淀粉酶的研究1.1α-淀粉酶分離純化方法的研究高純度α-淀粉酶是一種重要的水解淀粉類酶制劑，可用于研究酶反應(yīng)機(jī)理和測(cè)定生化反應(yīng)平衡常數(shù)等。分離純化α-淀粉酶的方法很多，一般都是依據(jù)酶分子的大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性、專一性結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)建

3、立的。要得到高純度的α-淀粉酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳等，是蛋白質(zhì)分離純化的主要方法。用吸附樹脂法、40%乙醇從α-淀粉酶發(fā)酵液中分離高活性α-淀粉酶，用離子交換法和透析法對(duì)初酶液進(jìn)行脫鹽處理，最后用DEAE－纖維素純化α－淀粉酶，所得酶活力為60153U/g，酶活性回收率為66.04%[2]。另通過乙醇沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析等方式，從白曲霉菌A.kawachii的米曲粗抽出液中，分離純化到兩個(gè)耐酸性α-淀粉酶比活性極高的組分。用疏水吸附法和DEAE-

4、cellulose(二乙氨基乙基-纖維素)柱層析法分離純化α-淀粉酶，所得酶活力為110000U/g。用硫酸銨沉淀和垂直板制備凝膠電泳對(duì)地衣芽孢桿菌A.4041耐高溫α-淀粉酶進(jìn)行分離純化，得到3種電泳均一的組分。通過超濾、濃縮、脫鹽和聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，對(duì)利用基因工程菌生產(chǎn)的重組超耐熱耐酸性α-淀粉酶進(jìn)行純化，得到電泳純級(jí)的超耐熱耐酸性α-淀粉酶，純化倍數(shù)為11.7，活力回收率為29.8%[3]。但上述方法存在的共同問題是，連續(xù)操作和規(guī)模放大都比較困難。雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用雙水

5、相系統(tǒng)PEG/磷酸鹽分離純化α-淀粉酶，增加PEG濃度有助于酶富集上相。同樣用PEG/磷酸鹽雙水相體系從發(fā)酵液中直接萃取分離低溫α-淀粉酶，分配系數(shù)及回收率分別為4.8和87%[4]5。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和硫酸銨對(duì)酶活力具有保護(hù)作用，利用PVP/硫酸銨液-固萃取體系分離提取耐高溫α-淀粉酶，酶活力回收率高，體系成相時(shí)間短，操作時(shí)不需雙水相體系所用的分液漏斗和離心操作，用傾液法即可實(shí)現(xiàn)相分離，因此，與雙水相體系相比，液-固萃取體系具有更大的優(yōu)越性[5]。1.2α-淀粉酶活力測(cè)定方法的研究測(cè)定α-淀粉酶活力的方法已不少于200種，

6、其共同之處是，被測(cè)樣品與某種多糖底物溶液保溫反應(yīng)后測(cè)之，很難標(biāo)準(zhǔn)化。碘-淀粉比色法測(cè)定α-淀粉酶活力的優(yōu)點(diǎn)是，操作簡便，試劑便宜，比色精確、敏感。因此，成為受推薦的淀粉酶活力測(cè)定方法。盛勤芳[6]提出要提高糖化型淀粉酶活力測(cè)定的準(zhǔn)確性須注意酶反應(yīng)時(shí)間的選擇和酶的控制。嚴(yán)控制測(cè)定時(shí)間十分重要，為了保證10min內(nèi)（初速度時(shí)間范圍內(nèi)）50℃，底物（淀粉液）必須預(yù)保溫5-10min。為了能得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)空白與樣品滴定值之差（B-A）一般控制在1.0-2.6ml；若（B-A）小于1.0ml，表明酶濃度過小；若（B-A）

7、大于2.6ml，表明酶濃度偏高。（B-A）這個(gè)值可以通過調(diào)整酶的稀釋倍數(shù)，使之控制在1.0-2.6ml范圍內(nèi)。1.3耐高溫α-淀粉酶的研究大多數(shù)淀粉酶生產(chǎn)的研究是以25-37℃[7，8]的溫度范圍的中溫菌開展的。但是為了節(jié)約生產(chǎn)成本，α-淀粉酶最好在高溫糊化（100-110℃）和液化（80-90℃）過程中保持活性，因此有必要尋找耐更高溫度的耐高溫α-淀粉酶。生產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌種有地衣芽孢桿菌、枯草桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝聚芽孢桿菌、酸熱芽孢桿菌以及普通高溫放線菌等。解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌

8、是最常用在溫度37-60℃[9]生產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。海洋紅嗜熱鹽菌，作為一種海洋嗜熱菌產(chǎn)生α-淀粉酶最高耐熱溫度為61℃[10]。用隨機(jī)整合法在地衣芽孢桿菌中表達(dá)了耐高溫α-淀粉酶基因，篩選出的陽性菌中α-淀粉酶基因表達(dá)水平比供體菌