分子生物學(xué)基本技術(shù)介紹.ppt

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1、實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)分子生物學(xué)部分存在問題1.基本的實(shí)驗(yàn)技能2.實(shí)驗(yàn)習(xí)慣3.責(zé)任感和安全性態(tài)度決定一切!!!核酸純化技術(shù)離心分離技術(shù)凝膠電泳技術(shù)核酸定量技術(shù)分子雜交技術(shù)序列分析技術(shù)………………一核酸純化技術(shù)原理1.核酸混合物成分:結(jié)構(gòu)類-細(xì)胞碎片，細(xì)胞器，其他大分子-DNA，RNA，Protein，糖類，脂類等小分子-氨基酸，小分子糖類和脂類，水，無機(jī)物等2.關(guān)鍵:DNA，RNA—Protein3.方案：Protein變性苯酚：強(qiáng)變性25氯仿：弱變性24異戊醇：消泡14.苯酚的處理：重蒸-飽和-pH重蒸：去除醌類氧化物飽和：防

2、止核酸損耗pH：pH7.0-8.0-核酸最適合方法：蒸餾（183℃）-收集（棕色瓶）-飽和與調(diào)pH（Tris-HClpH8.0）-0.1%8羥基喹啉-4℃或-20℃保存方法樣品+等體積飽和苯酚10kb以上輕柔混勻；10kb以下振蕩離心（12000*g）取上清核酸相Protein變性相有機(jī)相二離心技術(shù)原理離心力：F=ω2rmRCF=F/G=ω2r/g=（2π*rpm）2r/g=1.119*10-5(rpm)2r浮力密度：K=m-mp0/p沉降阻力：f*(dx/dt)RCF=k+f*(dx/dt)差速離心—密度梯度離心操作

3、離心機(jī)分類：普通6000rpm高速20000-25000rpm超速30000-80000rpm平衡溫度-離心力-轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭：角轉(zhuǎn)，平轉(zhuǎn)，垂直轉(zhuǎn)三凝膠電泳技術(shù)原理等電點(diǎn)：DNApI=6.0-7.0瓊脂糖-PAG：支持介質(zhì)U=V/E=（d/t）/（v/l）=Q/(6πrη)電泳影響因素1.DNA物理性質(zhì)質(zhì)粒：CC＞L＞OC線形：㏒10M正比1/m2.介質(zhì)性質(zhì)㏒10U=㏒10U0-KrT分離范圍：agrose：100bp-60kbPAG：5-500bp3.電壓：5v/cm4.緩沖液：TAE，TBE，TPE四核酸定量技術(shù)原理A=

4、㏒10（1/T）=abc濃度：稀溶液（A-0.05-1.0）+b=1cmDNA：1OD260=0.05ug/ulRNA：1OD260=0.04ug/uldsDNA：1OD260=0.033ug/ul純度：OD260/OD280=1.6-1.8五分子雜交技術(shù)六序列分析技術(shù)作業(yè)1.市售苯酚為什么要飽和與重蒸？2.離心操作應(yīng)該注意哪些問題？3.如果要分離470bp和5kbDNA應(yīng)該選擇什么凝膠？4.在核DNA定量時(shí)，取10uLDNA待測(cè)液，用TEbuffer稀釋到100uL后，加入到0.5cm的石英比色皿中。OD260測(cè)定為

5、0.21，問DNA待測(cè)液的濃度是多少？5.簡(jiǎn)述DNA序列分析的基本原理。任務(wù)采集植物葉片1.植物的科,種,屬2.取幼嫩葉片0.8克(中午)3.清洗干凈,擦干水分!?TheEnd!