沉淀反應(yīng)200803.ppt

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1、沉淀反應(yīng)馬榮紅協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科沉淀反應(yīng)（precipetation）是可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)。1905凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)1946試管免疫擴(kuò)散技術(shù)1965單向免疫擴(kuò)散技術(shù)1967散射比濁法形成肉眼可見(jiàn)的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點(diǎn)法就是測(cè)定此階段形成的復(fù)合物第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見(jiàn)。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率。液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)將抗原與抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合，形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗(yàn)受

2、到抗原和抗體比例的直接影響，因而產(chǎn)生了三種最適比例的基本測(cè)定方法。即抗原稀釋法抗體稀釋法方陣滴定法表6-1最適比方陣測(cè)定法抗體稀釋度抗原稀釋度1/101/201/401/801/1601/3201/640對(duì)照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—二、免疫濁度測(cè)定（immunoturbidimetry)是將現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器與自動(dòng)分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)。免疫濁度測(cè)定的影響因素1.抗原抗體的比例免疫比濁法基本原則：反

3、應(yīng)體系保持抗體過(guò)量免疫濁度測(cè)定的影響因素2、抗體的質(zhì)量特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力高、R型抗體3、抗原抗體復(fù)合物形成的反應(yīng)溶液最適pH為6.5-8.5，常使用磷酸鹽緩沖液4、增濁劑的作用消除抗原、抗體分子周?chē)碾娮釉坪退瘜樱龠M(jìn)分子靠近、結(jié)合。凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)最常用的凝膠為瓊脂糖原理：可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。大分子（分子量為20萬(wàn)以上）物質(zhì)在凝膠中擴(kuò)散較慢，可利用這點(diǎn)識(shí)別分子量的差別。根據(jù)抗原與抗體反應(yīng)的方式和特性，分為單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)原理：在

4、瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測(cè)的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)的沉淀環(huán)。根據(jù)試驗(yàn)形式可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法沉淀環(huán)的數(shù)目和形態(tài)受抗原和抗體性質(zhì)的影響。多種抗原多條區(qū)帶上部沉淀帶抗原量少或抗體量多應(yīng)用較少（二）平板法此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的簡(jiǎn)易抗原定量技術(shù)，其要點(diǎn)是：將抗體或抗血清混入約0.9％瓊脂糖內(nèi)（約50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37℃讓其向四周擴(kuò)散，24～48h后可見(jiàn)周?chē)霈F(xiàn)沉淀環(huán)。上排為5個(gè)不同的參考

5、中、下排為患者血清下排右2為一異常病理血清測(cè)量沉淀環(huán)的直徑或計(jì)算環(huán)的面積。沉淀環(huán)直徑或面積的大小與抗原量相關(guān)，但不是直線相關(guān)，而是對(duì)數(shù)關(guān)系。同時(shí)，這種沉淀環(huán)與分子量和擴(kuò)散時(shí)間有關(guān)。抗原含量與環(huán)徑的關(guān)系有兩種計(jì)算方法：1.Mancini曲線適用于大分子抗原和長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散（＞48h）的結(jié)果處理。擴(kuò)散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系；C/d2=KC抗原濃度d沉淀環(huán)直徑2.Fahey曲線這種曲線適用于小分子抗原和較短時(shí)間（24h）擴(kuò)散的結(jié)果處理。濃度的對(duì)數(shù)與擴(kuò)散圈直徑之間呈線性關(guān)系；logC/d=K待檢蛋白質(zhì)的3條要求：①備有僅對(duì)某待測(cè)抗原的單價(jià)特異抗

6、血清；②備有已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品；③待測(cè)品含量在1.25mg/L以上（單向擴(kuò)散技術(shù)的敏感度）。曾經(jīng)最常用于臨床檢測(cè)的項(xiàng)目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白。影響因素1．抗血清不但要求親和力強(qiáng)、特異性好、效價(jià)高，而且還應(yīng)注意存放的方法，防止效價(jià)下降。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定必須同時(shí)制作，決不可一次做成，長(zhǎng)期應(yīng)用。3．測(cè)定時(shí)必須同時(shí)加測(cè)質(zhì)控血清，以保證測(cè)量準(zhǔn)確性。影響因素4．有時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)散圈呈兩重沉淀環(huán)的雙環(huán)現(xiàn)象。這是由于出現(xiàn)了不同擴(kuò)散率、但抗原性相同的兩個(gè)組分。例如α重鏈病血清中出現(xiàn)的α重鏈和正常IgA

7、發(fā)生反應(yīng)，就形成內(nèi)外兩重環(huán)。影響因素5.在單向擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)結(jié)果與真實(shí)含量不符，這主要出現(xiàn)在Ig測(cè)定中。6．測(cè)得結(jié)果的假陽(yáng)性升高現(xiàn)象。雙向擴(kuò)散試驗(yàn)原理：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最恰當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可作出對(duì)抗原或抗體的定性分析。雙向擴(kuò)散試驗(yàn)方法：1.試管法試管法由Oakley首先報(bào)道。先在試管中加入含抗體的瓊脂，凝固后在中間加一層普通瓊脂，冷卻后將抗原液體加到上層。放置后，下層的抗體和上層的抗原向中間瓊脂層內(nèi)自由擴(kuò)散，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)處形成沉淀線。此法分析效果與O

8、udin法相似，在臨床檢驗(yàn)中罕用。雙向擴(kuò)散試驗(yàn)方法：2.平板法抗原抗體鑒定的基本方法打孔→加入抗原/抗體→孵育→分析結(jié)果結(jié)果分析1.抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量