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《白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（定稿）.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020B01DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T××××—××××大白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程DetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinChinesecabbage××××-××-××發(fā)布××××-××-××實(shí)施山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB37/T××××—××××前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳斌、辛
2、相啟、王升吉、姜珊珊、張眉、辛志梅。8DB37/T××××—××××大白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大白菜中蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒的間接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于山東省蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒在傳播介體蚜蟲和大白菜中的檢測(cè)。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 樣品采集與保存3.1 蚜蟲樣品采集在蚜蟲盛發(fā)初期進(jìn)行蚜蟲
3、樣品采集，于白菜田、周邊蔬菜田或田間雜草叢等蚜蟲喜好棲息環(huán)境，采用直徑33cm的35目紗網(wǎng)在田間隨機(jī)進(jìn)行掃撲，分揀裝入試劑瓶中，100%乙醇浸泡，-20℃以下冰箱保存?zhèn)溆谩?.2 葉片樣品采集采集表現(xiàn)TuMV和CMV花葉、皺縮、植株矮化、畸形等典型癥狀的大白菜葉片5g～10g，單株樣品袋存放。樣品采集后，在冷藏條件下（2°C～8°C）運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。如果樣品在2天內(nèi)檢測(cè)，可暫時(shí)儲(chǔ)存于2°C～8°C冷藏箱；如果樣品在2天以后檢測(cè)，保存至-80℃超低溫冰箱備用，樣品避免反復(fù)凍融。4 主要儀器設(shè)備、用具和試劑4.1 儀器設(shè)備儀器設(shè)備主要有：a)酶標(biāo)儀；b)洗板機(jī)；c)電子天平（感量0.001g）
4、；d)PCR儀；e)電泳儀；f)水平電泳槽；g)凝膠成像儀；h)高速冷凍離心機(jī)；i)水浴鍋；8DB37/T××××—××××a)樣品冷藏柜；b)低溫冰箱（-20°C）；c)超低溫冰箱（-80°C）；d)磁力攪拌器；e)高壓滅菌鍋；f)可調(diào)微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。1.1 用具用具主要有：a)無RNase吸頭（10μL、100μL、200μL、1000μL）；b)酶標(biāo)板；c)硝酸纖維素膜（NC膜）；d)無RNase離心管；e)PCR反應(yīng)管；f)研缽；g)樣品袋；h)標(biāo)簽；i)鑷子。1.2 主要試劑TuMV抗體、CMV抗體、酶標(biāo)二抗、TuMV特異性引物、C
5、MV特異性引物、Trizol、液氮、三氯甲烷、異丙醇、乙醇、M-MLVRT反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、DNA分子標(biāo)記、Gelred、瓊脂糖等。除特殊說明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑級(jí)別均為分析純級(jí)。試驗(yàn)用水為無菌超純水或去離子水，均符合GB/T6682-2008。血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)試劑配制見附錄A。2 檢測(cè)2.1 方法提要蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒的血清學(xué)特性與分子生物學(xué)特性是該病毒檢測(cè)方法的主要依據(jù)。兩種病毒都具有很強(qiáng)的免疫原性，同時(shí)都是RNA病毒，因此可利用間接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法確定樣品中是否帶有上述兩種病毒。2.2 間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定2.
6、2.1 樣品制備將單頭蚜蟲置于小型離心管內(nèi)，加300μL包被緩沖液研碎，4°C冰箱放置12h～16h；稱取待測(cè)植株樣品0.1g以上，按1：10（質(zhì)量：體積）加入包被緩沖液，用研缽研磨成漿，4°C冰箱放置4h～5h。將兩類研磨液8000r/min離心3min，上清液即為制備好的檢測(cè)樣品。設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，陰性對(duì)照樣品為試驗(yàn)室保存的未感染病毒的健康大白菜葉片，陽性樣品為試驗(yàn)室保存的感染TuMV或CMV的標(biāo)準(zhǔn)樣品，陰性樣品及陽性樣品皆通過RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序驗(yàn)證。陰性對(duì)照、陽性對(duì)照作相同的處理，樣品提取緩沖液作空白對(duì)照。2.2.2 加樣8DB37/T××××—××××在酶標(biāo)板上加入制備好
7、的待檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照，每個(gè)樣品平行加到兩個(gè)孔中，每孔加樣100μL，加蓋，4°C冰箱孵育12h～16h。1.1.1 洗板孵育結(jié)束后，用PBST清洗酶標(biāo)板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。1.1.2 加抗血清用抗體稀釋緩沖液按照相應(yīng)病毒抗血清的使用濃度進(jìn)行稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液100μL，加蓋，37°C孵育1.5h。1.1.3 洗板同5.2.3。1.1.4 加酶標(biāo)抗體
