分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作.doc

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1、.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作目錄1.質(zhì)粒提取1.1小提質(zhì)粒1.2小量快提質(zhì)粒鑒定：1.3大提質(zhì)粒：2.酶切2.1制備型酶切2.2小量酶切鑒定2.3DNA片段5'突出端的補(bǔ)平3.瓊脂糖凝膠電泳4.回收4.1從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段4.2小量膠回收DNA片段試劑盒操作（見操作手冊）4.3無水乙醇沉淀回收5.連接5.1一般連接5.2平端動態(tài)連接6.轉(zhuǎn)化6.1質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化6.2連接物轉(zhuǎn)化7.制普通固體培養(yǎng)板8.涂板9.挑菌10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)哺乳動物細(xì)胞單克隆株分離常用溶液、培養(yǎng)基配制..1.質(zhì)粒提取：1.1小提質(zhì)

2、粒：本實(shí)驗(yàn)室在常規(guī)條件下采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒(1)從平板上挑取單菌落或搖甘油菌(5～50uL)，接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中（加有相應(yīng)的抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD2.0以上，但也無需過濃。*通常DH5а菌株搖12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr*(2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未滅菌的新管）中，12000rpm離心15～30sec，棄上清。通?？扇?.5mL菌液再離心一次，棄去上清后在紙上扣干。*不要忘記將用完的試管及管蓋放入指定處以備回收處理*(3)加入150uL溶液I，

3、振蕩使菌體沉淀充分懸浮。*務(wù)必懸浮完全*(4)加入150uL溶液II，立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解。*可觀察到原渾濁的菌懸液變清變粘*(5)加入180uL溶液Ⅲ，立即上下顛倒充分混勻7～10次，不宜太劇烈。*可觀察到白色團(tuán)片狀沉淀出現(xiàn)。*(6)置冰浴10分鐘，也可置于-20℃中5min。(7)12000rpm離心8～10分鐘。(8)在離心過程中可取未滅菌的新1.5mLEppendorf管，加入等體積(350～400uL即可)酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）備用；取滅菌過的新1.5mLEppendorf管，加入2倍體積(780uL即可)

4、的無水乙醇置于-20℃?zhèn)溆谩?加酚-氯仿-異戊醇時要小心，應(yīng)吸位于下層的酚相，而不要帶入上層的Tris-cl保護(hù)液*(9)離心完將上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-異戊醇中,充分混勻。*小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中*(10)12000rpm離心4～5分鐘。(11)吸水相，加入已加好的無水乙醇中,顛倒混勻幾次。*小心不要吸入酚相，沒把握時寧愿放棄一些水相*(12)-20℃放置5～15分鐘。(13)12000rpm離心10分鐘。(14)迅速棄上清，沉淀用適量70%乙醇洗一次，于紙上扣干。*小心不要將沉淀洗掉*(15)置于恒溫器上干

5、燥(55℃)至無色透明或無乙醇?xì)馕叮话愦蠹s5～10min。(16)加入30～40uL1×TE緩沖液溶解沉淀，-20℃儲存?zhèn)溆谩?做完實(shí)驗(yàn)請及時收拾實(shí)驗(yàn)臺*1.2小量快提質(zhì)粒鑒定：（目前較少采用）(1)取培養(yǎng)的菌液1mL，12000rpm離心30s，收集菌體，在紙上扣干殘留培養(yǎng)液。(2)用50uL無菌水充分懸浮菌體。..(3)每管加入50uL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1）并充分混勻。(4)12000rpm離心10分鐘。(5)小心吸取5uL上清上樣電泳。(對于插入片段足夠大的重組子，其遷移率應(yīng)低于未插入片段的對照質(zhì)粒。)*做完實(shí)驗(yàn)請及

6、時收拾實(shí)驗(yàn)臺*1.3大提質(zhì)粒：(1)從－20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液，接種到3～4mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為1.6～1.8。(2)取0.5mL菌液接種到200mLLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0以上，再加入氯霉素至170ug/mL，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12～16hr。(3)將搖好的菌液4000rpm離心15min。(4)棄上清，敞開離心管口倒置，盡量讓上清全部流盡。(5)用預(yù)冷的40mLSTE充分懸浮菌體沉淀。(6)4℃，4000rpm離心10min。(7)棄上清，敞開離心管口倒置，讓上清全部流

7、盡。(8)用預(yù)冷的4mL溶液Ⅰ充分懸浮菌體沉淀。(9)加入新鮮配制的溶液Ⅱ8mL，上下顛倒幾次，液體會變得澄清，置于4℃10min。(10)加入預(yù)冷的溶液Ⅲ6mL，上下顛倒混勻后，4℃中放置30min。(11)4℃，12000rpm離心10min。(12)收集上清，加等體積的異丙醇，4℃放置30min。(13)4℃，10000rpm離心10min。(14)棄上清，用70％的乙醇洗沉淀一次，室溫吹干，溶于1mL1×TE中。(15)加50uLRNaseA，37℃作用2小時。(16)加1mL新配制的13％的PEG8000溶液（13%PEG80

8、00，1.6MNaCl），充分混勻，4℃放置30min。(17)4℃，12000rpm離心15min。(18)吸去上清，用400uL1×TE溶解沉淀。(19)加1/4體積4MLiCl，室溫放置5min，12