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《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作.doc》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作目錄1.質(zhì)粒提取1.1小提質(zhì)粒1.2小量快提質(zhì)粒鑒定:1.3大提質(zhì)粒:2.酶切2.1制備型酶切2.2小量酶切鑒定2.3DNA片段5'突出端的補(bǔ)平3.瓊脂糖凝膠電泳4.回收4.1從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段4.2小量膠回收DNA片段試劑盒操作(見操作手冊)4.3無水乙醇沉淀回收5.連接5.1一般連接5.2平端動態(tài)連接6.轉(zhuǎn)化6.1質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化6.2連接物轉(zhuǎn)化7.制普通固體培養(yǎng)板8.涂板9.挑菌10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)哺乳動物細(xì)胞單克隆株分離常用溶液、培養(yǎng)基配制..1.質(zhì)粒提取:1.1小提質(zhì)
2、粒:本實(shí)驗(yàn)室在常規(guī)條件下采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒(1)從平板上挑取單菌落或搖甘油菌(5~50uL),接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中(加有相應(yīng)的抗生素),37℃振蕩培養(yǎng)至OD2.0以上,但也無需過濃。*通常DH5а菌株搖12~14hr;JM1017~8hr;ER256610~12hr*(2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管(可取未滅菌的新管)中,12000rpm離心15~30sec,棄上清。通??扇?.5mL菌液再離心一次,棄去上清后在紙上扣干。*不要忘記將用完的試管及管蓋放入指定處以備回收處理*(3)加入150uL溶液I,
3、振蕩使菌體沉淀充分懸浮。*務(wù)必懸浮完全*(4)加入150uL溶液II,立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下,使菌體裂解。*可觀察到原渾濁的菌懸液變清變粘*(5)加入180uL溶液Ⅲ,立即上下顛倒充分混勻7~10次,不宜太劇烈。*可觀察到白色團(tuán)片狀沉淀出現(xiàn)。*(6)置冰浴10分鐘,也可置于-20℃中5min。(7)12000rpm離心8~10分鐘。(8)在離心過程中可取未滅菌的新1.5mLEppendorf管,加入等體積(350~400uL即可)酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)備用;取滅菌過的新1.5mLEppendorf管,加入2倍體積(780uL即可)
4、的無水乙醇置于-20℃?zhèn)溆谩?加酚-氯仿-異戊醇時要小心,應(yīng)吸位于下層的酚相,而不要帶入上層的Tris-cl保護(hù)液*(9)離心完將上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-異戊醇中,充分混勻。*小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中*(10)12000rpm離心4~5分鐘。(11)吸水相,加入已加好的無水乙醇中,顛倒混勻幾次。*小心不要吸入酚相,沒把握時寧愿放棄一些水相*(12)-20℃放置5~15分鐘。(13)12000rpm離心10分鐘。(14)迅速棄上清,沉淀用適量70%乙醇洗一次,于紙上扣干。*小心不要將沉淀洗掉*(15)置于恒溫器上干
5、燥(55℃)至無色透明或無乙醇?xì)馕叮话愦蠹s5~10min。(16)加入30~40uL1×TE緩沖液溶解沉淀,-20℃儲存?zhèn)溆谩?做完實(shí)驗(yàn)請及時收拾實(shí)驗(yàn)臺*1.2小量快提質(zhì)粒鑒定:(目前較少采用)(1)取培養(yǎng)的菌液1mL,12000rpm離心30s,收集菌體,在紙上扣干殘留培養(yǎng)液。(2)用50uL無菌水充分懸浮菌體。..(3)每管加入50uL酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)并充分混勻。(4)12000rpm離心10分鐘。(5)小心吸取5uL上清上樣電泳。(對于插入片段足夠大的重組子,其遷移率應(yīng)低于未插入片段的對照質(zhì)粒。)*做完實(shí)驗(yàn)請及
6、時收拾實(shí)驗(yàn)臺*1.3大提質(zhì)粒:(1)從-20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液,接種到3~4mL的LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為1.6~1.8。(2)取0.5mL菌液接種到200mLLB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為2.0以上,再加入氯霉素至170ug/mL,37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12~16hr。(3)將搖好的菌液4000rpm離心15min。(4)棄上清,敞開離心管口倒置,盡量讓上清全部流盡。(5)用預(yù)冷的40mLSTE充分懸浮菌體沉淀。(6)4℃,4000rpm離心10min。(7)棄上清,敞開離心管口倒置,讓上清全部流
7、盡。(8)用預(yù)冷的4mL溶液Ⅰ充分懸浮菌體沉淀。(9)加入新鮮配制的溶液Ⅱ8mL,上下顛倒幾次,液體會變得澄清,置于4℃10min。(10)加入預(yù)冷的溶液Ⅲ6mL,上下顛倒混勻后,4℃中放置30min。(11)4℃,12000rpm離心10min。(12)收集上清,加等體積的異丙醇,4℃放置30min。(13)4℃,10000rpm離心10min。(14)棄上清,用70%的乙醇洗沉淀一次,室溫吹干,溶于1mL1×TE中。(15)加50uLRNaseA,37℃作用2小時。(16)加1mL新配制的13%的PEG8000溶液(13%PEG80
8、00,1.6MNaCl),充分混勻,4℃放置30min。(17)4℃,12000rpm離心15min。(18)吸去上清,用400uL1×TE溶解沉淀。(19)加1/4體積4MLiCl,室溫放置5min,12