質(zhì)粒不穩(wěn)定性.ppt

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1、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性分析質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的現(xiàn)象克隆有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌受體細(xì)胞之后，會(huì)產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，影響到自身的穩(wěn)定性、可能引起形態(tài)學(xué)上的變化：絲狀現(xiàn)象和脆性增加。產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒的突變體或拷貝數(shù)低的突變體。結(jié)構(gòu)重排導(dǎo)致無(wú)法正常表達(dá)的突變體。質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離不穩(wěn)定性指在細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增殖為無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體機(jī)構(gòu)不穩(wěn)定性由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排和丟失。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性原因：DNA的丟失，插入和重排。人工構(gòu)建的多個(gè)串聯(lián)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體容易發(fā)生丟失作用。寄主染色

2、體及質(zhì)粒載體的IS因子或轉(zhuǎn)位因子，同樣也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。共同特征：同向重復(fù)序列之間的同源重組（shortdirectrepeat).例如：用含有酪氨酸操縱子的多拷貝質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)換大腸桿菌tryR菌株時(shí)，由于IS1因子的插入效應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生出具有插入或者缺失的修飾型的質(zhì)粒載體。分離的不穩(wěn)定性原因：細(xì)胞分裂過(guò)程中的質(zhì)粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的兩個(gè)必要條件：一、平均每個(gè)時(shí)代每個(gè)質(zhì)粒至少發(fā)生一次復(fù)制；二、細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)?？截?/p>

3、必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。質(zhì)?？截惙峙涞阶蛹?xì)胞的途徑可分為主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種不同的方式。主動(dòng)分配的方式有兩種:平均分配--每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截惻鋵?duì)位點(diǎn)分配—只有一對(duì)質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其他的隨機(jī)分配。由于主動(dòng)分配存在著有效的質(zhì)?？截悢?shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質(zhì)粒的高度穩(wěn)定。隨機(jī)分配在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒拷貝數(shù)在兩個(gè)子細(xì)胞中隨機(jī)分配。影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)拷貝數(shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒載體增加給宿主細(xì)胞DNA復(fù)制效應(yīng)

4、曲線。即宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速片度與質(zhì)粒載體的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的時(shí)間就越長(zhǎng)?？截悢?shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響差異：同樣的大腸桿菌培養(yǎng)物中，每個(gè)細(xì)胞所擁有的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)是不盡相同的，這種不同的細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)差異程度，簡(jiǎn)稱差度。無(wú)質(zhì)粒載體細(xì)胞的速度是由分裂細(xì)胞中的質(zhì)粒載體拷貝平均值數(shù)決定的。（實(shí)際質(zhì)粒載體拷貝數(shù)是實(shí)驗(yàn)測(cè)定大量細(xì)胞的）差度是影響質(zhì)粒載體丟失的速率，也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。具低差度分布特性的質(zhì)粒載體相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定，具有高差度分布特性的質(zhì)粒載體穩(wěn)定性較差。位于后者的這種分布

5、的低拷貝數(shù)的一段產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒載體細(xì)胞的頻率相當(dāng)高。寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒寡聚體同樣是造成質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆載體。實(shí)驗(yàn)證明，pBR322派生載體中，寡聚化程度與插入片段大小存在相關(guān)性。決定大腸桿菌培養(yǎng)物中含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的比例有兩種主要的因素：一、質(zhì)粒DNA分子間的重組頻率；二、含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞生長(zhǎng)速率。影響質(zhì)粒重組的突變同樣也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)觀察表明，在重組缺陷(rec-)的大腸桿菌寄主細(xì)胞中，基因工程常用載體pBR322和pUC當(dāng)以單體形式存在時(shí)最穩(wěn)定。隨著

6、質(zhì)粒寡聚體比例的逐漸上升，其穩(wěn)定性就相應(yīng)的下降。一般情況下,質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性可以通過(guò)宿主菌株的謹(jǐn)慎和恰當(dāng)?shù)倪x用來(lái)消除。因此在質(zhì)粒不穩(wěn)定性的研究過(guò)程中,人們關(guān)注最多的,通常是質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。產(chǎn)腈水合酶重組大腸桿菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性研究本文對(duì)成功構(gòu)建的腈水合酶(nitrilehydratase,NHase)高表達(dá)的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr)的重組質(zhì)粒pETNHM在重組菌株中的質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。質(zhì)粒pETNHM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性質(zhì)粒pETNHM是將α亞基起始密碼子突變的諾卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的p

7、ET28a(+)(Novagen公司)質(zhì)粒載體而得到的,插入位點(diǎn)為NcoI和BamHI在LB培養(yǎng)基中對(duì)重組E.coliBL21(DE3)/pETNHM每隔6h進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng),約60代后收獲細(xì)胞提取質(zhì)粒,并對(duì)初始構(gòu)建的質(zhì)粒和傳代培養(yǎng)后的質(zhì)粒分別以EcoT22I單酶切及NcoI和BamHI雙酶切，然后瓊脂糖凝膠電泳。由圖可見(jiàn),連續(xù)傳代60代后收獲的質(zhì)粒樣品采用EcoT22I單酶切及NcoI和BamHI雙酶切后,分別獲得了與初始質(zhì)粒完全相同的預(yù)期長(zhǎng)度基因片段(EcoT22I單酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片斷因

8、為太小而在瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)不到;NcoI和BamHI雙酶切:5.3kb和1.3kb)。進(jìn)一步將連續(xù)復(fù)制60代后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主E.coliBL21(DE3),并對(duì)重組菌進(jìn)行腈水合酶的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明腈水