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1、實(shí)驗(yàn)三骨髓法制備小白鼠染色體標(biāo)本第二部分細(xì)胞遺傳學(xué)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備的方法及操作技術(shù)。2、進(jìn)一步觀察了解畜禽染色體的形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)特征。在骨髓細(xì)胞中，有絲分裂的指數(shù)是相當(dāng)高的，通過注射秋水仙素使正在分裂的細(xì)胞停止在有絲分裂中期，再經(jīng)過低滲、固定、滴片就可以獲得大量的骨髓細(xì)胞染色體分裂相。二、實(shí)驗(yàn)原理1、研究染色體的材料處于分裂旺盛期的組織：（1）動物的骨髓、外周血淋巴細(xì)胞、睪丸等。（2）果蠅三齡幼蟲的唾腺（3）植物的根尖（如洋蔥）2、研究染色體的方法1、材料獲取直接獲取細(xì)胞（骨髓、唾腺）細(xì)胞培養(yǎng)（豬淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法）2、非切片法滴片法－－細(xì)胞培養(yǎng)材料、骨髓壓片法－
2、－果蠅唾腺，植物的根尖{{三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑材料：小白鼠（22～25g）。儀器：顯微鏡、注射器、10ml離心管、吸管、試管架、載玻片、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、剪刀、磁盤、鑷子等。試劑：秋水仙素、KCl、磷酸緩沖液、冰醋酸、甲醇、Giemsa液等。1、秋水仙素處理：取骨髓前2～3h，給小白鼠腹腔注射秋水仙素液（注射劑量為2μg/g小白鼠體重）四、制備步驟2、殺鼠取髓：采用脫頸椎法處死小白鼠。用剪刀剪開后腿上的皮膚和肌肉，取出股骨，剔凈皮肉，再用剪刀剪掉股骨兩端，用注射器分兩次吸取0.075MKCl溶液（共5ml）通過針頭注入骨髓腔緩慢將細(xì)胞沖入離心管，反復(fù)沖洗直到骨髓腔發(fā)白為止。注意事項(xiàng)：
3、注射器剪掉剪掉3、低滲：將獲得的骨髓懸液用吸管立即將細(xì)胞團(tuán)吹散打勻，兩組同時放入37℃恒溫水浴鍋內(nèi)低滲30min。低滲結(jié)束時，向試管中加入加預(yù)固定液（甲醇：冰乙酸＝3:1，現(xiàn)配現(xiàn)用）8～10滴，混合均勻（以防細(xì)胞結(jié)團(tuán)），平衡（注意2管同時離心）后1000r/min離心10min，棄上清。4、第一次固定：在棄去上清液的試管中。加入新配的3:1甲醇冰醋酸固定液5~6ml，用吸管輕輕吸打均勻，室溫靜置30min進(jìn)行第一次固定。平衡后1000r/min離心10min，棄上清（可留0.5ml）。5．第二次固定：在棄去上清液的試管中。加入新配的3:1甲醇-冰醋酸固定液5~6ml，用吸管輕輕吸打均勻，室
4、溫靜置30min進(jìn)行第二次固定。平衡后1000r/min離心10min，棄上清（留0.2ml左右）。6、滴片：在棄去上清液的試管中加入適量（2～10滴，在老師輔導(dǎo)下加）新配固定液，用吸管吹打均勻制成細(xì)胞懸液，滴2～3滴于冰凍的載玻片上，立即用嘴吹氣使細(xì)胞迅速分散，在載玻片后面一角寫上學(xué)號，空氣干燥。7、染色：將染色體制片細(xì)胞面朝下反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀釋液染色30min，小水流自來水沖洗浮色，空氣干燥后，顯微鏡下觀察。小白鼠睪丸細(xì)胞分裂10倍物鏡下小白鼠的染色體分裂相（2n＝40）五、骨髓法需要注意的問題1、秋水仙素的量一定要合適，太少分裂相少，太多染色體短粗。2、為了節(jié)省
5、時間，可直接用低滲液（約5ml）沖骨髓入離心管。3、注意將兩組離心管同時放入水浴鍋中，由1人記錄時間，同時進(jìn)行預(yù)固定，然后離心。4、低滲時間一定要嚴(yán)格時間,加預(yù)固定液8滴，混合均勻平衡離心（注意2人一組同時離心）低滲的作用？目的是使低滲液在一定溫度、一定時間內(nèi)滲入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞漲大，細(xì)胞膜變薄，在滴片時細(xì)胞才能破裂，染色體才能平鋪在載玻片上。實(shí)驗(yàn)證明小鼠和雛雞都用37℃20～21分鐘最好。預(yù)固定的作用？在低滲結(jié)束后，往細(xì)胞懸液中加入甲醇：冰醋酸（3：1）約1ml，可以使細(xì)胞表面輕微固定，以防止細(xì)胞結(jié)團(tuán)。固定的作用？為了除去染色體中的蛋白質(zhì)，使得染色體分散良好清晰可見，在實(shí)驗(yàn)中如果發(fā)現(xiàn)分散不
6、夠好，可采取延長固定時間或用甲醇：冰醋酸=3:1再固定一次可以改善染色體分散情況。六、作業(yè)1、每個人完成一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告，寫明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、材料器具試劑、步驟、繪出你所做的染色體標(biāo)本圖形。2、如失敗，請分析失敗的可能原因。3、請對本次實(shí)驗(yàn)提出改進(jìn)意見，并寫出實(shí)驗(yàn)體會。謝謝!
