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1、分子生物學實驗腺嘌呤脫氨酶基因工程菌的構建Ｗ日8AM—5PMTA質粒（含ade基因）pMal-c2x質粒雙酶切電泳雙酶切產物片段的回收目的基因與載體片段連接（過夜）實驗內容：酶切和連接反應E.coliTB1菌株37℃過夜培養(yǎng)，第二天做感受態(tài)細胞用。Ｗ一 8AM—5PM實驗內容：感受態(tài)細胞的制備和轉化原理1.細菌在0?CCaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。2.質粒DNA粘附在細菌細胞表面，經過42?C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)
2、一代，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。Ｗ二1PM—5PM實驗內容：挑單斑，搖菌收平板挑取單斑（白斑）搖菌：30—50mL,用于提取質粒Ｗ三8AM—5PM質粒提取實驗內容：轉化克隆的篩選和鑒定電泳觀察PCR篩選雙酶切鑒定雙酶切反應TA質粒和pMal-c2x質粒分別以EcoRⅠ（GAATTC）和SalⅠ（GTCGAC）進行雙酶切，20μL質粒酶切反應體系如下：TA質粒pMal-c2x質粒7μL9μL10×EcoRⅠ緩沖液2μL2μLBSA0.2μL0.2μL水0.8μL
3、0.8μLEcoRⅠ0.5μL0.5μLSalⅠ0.5μL0.5μL無菌水9μL7μL37℃酶切反應2小時。注意事項：內切酶要放到最后加入電泳及凝膠回收瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶切產物，使用UNIQ-10柱式凝膠回收試劑盒分別對目的基因片段（TA質粒酶切反應中得到的1.7Kb片段）和載體片段（pMal-c2x質粒酶切反應中得到6.6Kb片段）進行凝膠回收。1.ExcisetheDNAfragmentfromtheagarosegelwithaclean,sharpscalpel.Weighthegel
4、sliceandtransfertoa1.5-mlmicrofugetube.2.???Add400mlofBindingBufferⅡto1volumeofgel(100mg=100ml).Incubateat50-60℃for10minutesandshakeoccasionallyuntilagaroseiscompletelydissolved.3Placeaspincolumnina2-mlcollectiontube.Transfertheabovemixturesolutionto
5、thespincolumn.Letitstandfor2minutes.Spinat8,000rpmfor1minuteanddiscardtheflow-throughinthetube.4.??Add500mlofWashSolution,andspinat8,000rpmfor1minute.Discardthesolutioninthetube.5.?Repeatstep4.Spinat10,000rpmforadditional30secondstoremoveresidualWash
6、buffer.6.??Placethecolumninanewclean1.5-mlmicrofugetube.Add30-40mlofElutionBuffertothecenterpartofthemembraneofthecolumnandincubateat37or50℃for2minutes.Spinat10,000rpmfor1minutetoeluteDNA.StoretheDNAelutionin–20℃freezer.BindingBufferⅡ是否有沉淀可適當延長時間Wash
7、Solution中加入乙醇的比例洗脫時間延長?。?！注意任一步驟的殘液不要倒掉——以防丟失目的DNA連接反應⑴在滅菌的0.5mL離心管中進行。 ⑵10μL體積反應體系中：2×快速連接緩沖液5μL目的基因的雙酶切產物XμLpMal-c2x質粒雙酶切產物XμLT4-DNA連接酶0.3μL⑶輕輕混勻，室溫下放置過夜。注意事項：目的基因和c2x質粒雙酶切產物的加入比例應根據(jù)電泳結果而定，使加入的2片段的濃度比為1：1剩下的酶切片段不要丟掉，留做轉化時做對照感受態(tài)菌的制備（1）E.coliTB1菌株37℃過
8、夜培養(yǎng)以復蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液1mL加入到50mLLB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min振蕩培養(yǎng)3h，至A600約為0.4左右。（2）無菌條件下，將50mL菌液轉移至離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。（3）在預冷4℃的離心機上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入5mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃離心10min，棄去上清，每50mL初始培養(yǎng)物用2mL預冷的含有10%~20%甘油的0.1mol/
