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1、豬精液冷凍保存技術(shù)吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李兆華內(nèi)容豬精液冷凍保存的意義豬精液冷凍技術(shù)研究概況豬精液冷凍技術(shù)操作流程影響豬精液冷凍效果的因素如何提高冷凍保存后豬精子的繁殖力1、延長公豬使用年限；2、獲得更大的遺傳進(jìn)展；2、取代活體公豬的引進(jìn)；3、生物安全的保證。豬精液冷凍保存的意義從意大利人Spallanzani最早開始研究哺乳動物精液冷凍開始至己有200多年的歷史。豬的精液冷凍研究是從1949年英國人Polge等發(fā)現(xiàn)甘油(丙三醇)對牛精子具有抗凍保護(hù)作用后開始的。1956年，他首次報道了應(yīng)這個原理進(jìn)行豬精液的冷凍操作，并進(jìn)行人工授精。1957年Hess等將豬凍精經(jīng)子宮頸輸入，
2、并產(chǎn)下仔豬。1975年，Pursel等發(fā)明了簡便的豬精液冷凍和解凍方法，從此打開豬冷凍精液的商品化之路。（用顆粒狀冷凍精液給23頭青年母豬輸精,48h后剖檢11頭,有5頭受孕;25-30d后剖檢另外12頭,有10頭懷孕）豬精液冷凍技術(shù)研究概況豬精液冷凍技術(shù)研究概況我國從70年代初期開始對豬精液冷凍技術(shù)進(jìn)行探索。1975年西安市草灘農(nóng)場試配了8頭母豬。1977年成立了全國豬凍精協(xié)作組。1986年冷凍精液累計配種母豬6萬余頭，近幾年：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)張兆旺教授南京農(nóng)業(yè)大學(xué)芮榮教授西北農(nóng)林科技大學(xué)李青旺教授四川農(nóng)業(yè)大學(xué)馬恒東教授東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉娣教授上海農(nóng)科院張德福研究員豬精液冷凍
3、技術(shù)操作流程精液采集質(zhì)量檢測第一次稀釋降溫、平衡（15℃，5℃）第二次稀釋平衡冷凍保存豬精液冷凍技術(shù)操作流程顆粒法凍精的冷凍程序1)新鮮精液在常溫、等溫條件下，用不含甘油的I液稀釋，然后平衡0.5～2h;2)緩慢降溫至15℃維持4h，再從15℃經(jīng)1h降至5℃;3)用等溫的含甘油的II液進(jìn)行稀釋。4)稀釋后用液氮熏蒸法制作凍精顆粒。利用廣口液氮罐，以聚四氟乙烯板作為冷凍面，冷凍面與液氮面距離為1～2cm，待冷凍面充分預(yù)冷后，用預(yù)冷的滴凍管在氟板上連續(xù)等量滴凍。其始凍溫度為-110～-125℃，滴凍時間控制在60s內(nèi)完成，加蓋熏蒸平衡3～4分鐘后，浸入液氮中保存。細(xì)管法和塑
4、料袋法的冷凍程序1)新鮮精液在室溫下，用稀釋液將精液按比例等溫稀釋，然后平衡0.5～2h。2)將精液移入15℃條件下降溫平衡3h。3)在15℃條件下離心(800g，10min),加入無甘油的I液，緩慢降到5℃，平衡2h，加入含甘油的II液，然后分裝。4)程序冷凍儀冷凍：初始溫度為5℃，以3℃／min從5℃降到-5℃，再于-5℃條件下保持1min結(jié)晶，然后以50℃／min從-5℃降到-140℃，然后投入液氮保存。5)液氮熏蒸冷凍：在廣口液氮罐內(nèi)，與液氮面距離5cm處，熏蒸20分鐘，然后投入液氮保存。影響豬精液冷凍效果的因素個體的影響個體對精液凍后效果影響極大。應(yīng)用限制性片
5、斷長度多態(tài)(AFLP)分析控制精子冷凍能力的基因，沒有發(fā)現(xiàn)差異。差異的機制仍需要繼續(xù)研究凍前處理的影響冷休克：可能原因是質(zhì)膜中特別的組成成分所致。豬精子膜磷脂酰膽堿的含量較牛低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高膽固醇/磷脂的比例低，且膽固醇的分布不對稱，外膜的分布量大于內(nèi)膜離心：800g，10min影響豬精液冷凍效果的因素冷凍保存承載工具的影響承載工具：顆粒、0.25mL、0.5mL小型細(xì)管和扁平細(xì)管；5mL的大型細(xì)管5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack，300mm×22mm×0.2mm)和MFP(amultipleFlat-Pack)。冷凍解凍程序的影響冷凍速率：3
6、0～50℃/min。解凍速率：1200～1800℃/min冷凍0.25mL微型細(xì)管：50℃/min、1.5％甘油濃度；0.5mL小型細(xì)管：30℃/min、3％甘油濃度；5mL大型細(xì)管：16℃/min、3.3％甘油濃度。解凍0.25mL、0.5mL細(xì)管：50℃，12s或37℃，20s；5mL細(xì)管：50℃，40s5mL塑料袋：50℃，13s影響豬精液冷凍效果的因素稀釋液的組成大體上，包括糖，蛋白質(zhì)，脂類，緩沖劑，冷凍保護(hù)劑和一些添加物質(zhì)。滲透壓的影響最佳滲透壓：420～580mOsm/Kg為最佳滲透壓糖的影響雙糖（半乳糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、蔗糖等）頂體完整率；單糖（尤其
7、是果糖和木糖）精子凍后活率。配合使用效果比單一使用好影響豬精液冷凍效果的因素冷凍保護(hù)劑的影響常用：甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿東糖醇等。作用過程：（1）沖淡溶液中溶質(zhì)鹽濃度，細(xì)胞攝入鹽量減少，由抗凍劑代替；（2）抗凍劑進(jìn)入細(xì)胞，改變了胞內(nèi)過冷狀態(tài)，使胞內(nèi)壓接近胞外壓，降低了細(xì)胞脫水皺縮程度和速度；（3）抗凍劑進(jìn)入細(xì)胞，緩解了精子在解凍時的滲透性腫脹引起的損傷。效果：甘油保護(hù)效果最好，但有毒。方向：聯(lián)合使用，最終除去甘油影響豬精液冷凍效果的因素添加物的影響緩沖：磷酸二氫鉀、檸檬酸鈉、T
