miRNA引物設(shè)計方法 (1).ppt

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1、Real-timePCR引物參賽主講：****引物設(shè)計原則1、引物長度一般為15~30個核苷酸。引物過短會使PCR的特異性降低，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物中G+C的含量在45~55%左右。設(shè)計引物時要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于

2、54°C3、引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按經(jīng)驗，引物自身存在的連續(xù)互補序列，一般不超過3bp。4、兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補重疊。5、引物的堿基序列不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性。尤其是引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。6、引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。7、引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括

3、起始密碼子，終止密碼子等。在PCR的起始反應(yīng)中，引物5′端游離的堿基并不影響引導(dǎo)新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此引物參與的PCR產(chǎn)物，既含有目的擴增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列。引物設(shè)計原則成熟序列反義連3'端后6-8個堿基做完RT引物的粘附序列部分ACAACCRT引物的莖環(huán)序列5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC-3’莖環(huán)序列（前）+粘附序列（后）構(gòu)成miRNA的RTprimer5’-GTCGTAT

4、CCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACAACC-3’成熟序列反義連3‘端后6-8個堿基做為RT引物的粘附序列部分ACAACC上游引物下游引物RT引物分析粘貼的成熟序列反義鏈端不在頸環(huán)結(jié)構(gòu)中，可用