小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn).ppt

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1、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室熊潔原理（體外法）巨噬細(xì)胞具有吞噬異物的功能，將巨噬細(xì)胞與被吞噬物(雞紅細(xì)胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同溫育，染色，在油鏡下計(jì)數(shù)吞噬異物的巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，以此判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)白色念珠菌的吞噬功能。材料1．小白鼠2．白色念珠菌液（美蘭染液著色）3．6％可溶性淀粉肉湯肉湯培養(yǎng)液100m1，加入可溶性淀粉6g，混勻后煮沸滅菌4．小鼠解剖器械、顯微鏡、離心機(jī)、溫箱等5．試管、吸管、微量加樣器、計(jì)數(shù)板方法(1)、小鼠巨噬細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)前三天每

2、只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml。實(shí)驗(yàn)時(shí)眼球放血、斷椎處死小鼠，新潔爾滅浸泡5分鐘。剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹膜，用鑷子夾起腹膜剪開(kāi)一小口(注意避開(kāi)血管)，用1640灌注腹腔，收集腹腔液于試管中(約4ml)，1500r/min，離心10min，去上清，沉積細(xì)胞用1640離洗一次。最后沉積細(xì)胞用含10％小牛血清1640配成適當(dāng)濃度備用(1-2×106／ml)。（2）白色念珠菌制備將白色念珠菌接種于沙氏平皿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)，收集菌，用適量生理鹽水配成懸液，100℃，煮沸30min滅活，離心去掉上清，再用1％美蘭染色30min，用生理鹽水洗滌二次，用生理鹽水配成1×108

3、／ml菌懸液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）吞噬細(xì)胞與菌混合培養(yǎng)取巨噬細(xì)胞0.5ml加白色念珠菌懸液0.5ml，置37℃溫育30min。取1滴混合液置玻片上加蓋玻片，在高倍鏡下觀察計(jì)數(shù)。高倍鏡下觀察計(jì)算：吞噬率％=(吞噬白色念珠菌的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞)×100％吞噬指數(shù)％=100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬白色念珠菌總數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞**(吞噬指數(shù)式中巨噬細(xì)胞為陽(yáng)性吞噬細(xì)胞)注意事項(xiàng)1、菌與細(xì)胞混合后充分混勻非常重要。對(duì)于此實(shí)驗(yàn)，菌與吞噬細(xì)胞之比10：1時(shí)吞噬作用容易觀察和計(jì)數(shù)。但是吞噬效果好，能真正反映實(shí)際情況又可被檢測(cè)的比例為1：1。2、菌和細(xì)胞在搖床中作用的時(shí)間不超

4、過(guò)30min，如果在37?C條件下作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，被吞噬的菌很快會(huì)被裂解，也就不能計(jì)數(shù)為吞噬了菌的細(xì)胞。3、滴片時(shí)加入的細(xì)胞數(shù)依細(xì)胞的大小而定，如果使用的吞噬細(xì)胞是細(xì)胞系，細(xì)胞體積較大，那么加入的細(xì)胞數(shù)就相應(yīng)的少一點(diǎn)。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板是由一塊厚玻片特制而成，其中央有兩個(gè)計(jì)數(shù)室。每個(gè)計(jì)數(shù)室劃分出9個(gè)大方格（見(jiàn)下圖），每格面積1mm2，加蓋玻片后的深度為0.1mm。因此，每大方格容積為0.1mm3。四角的大方格，又分為16個(gè)中方格，適用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)。中央大方格以雙線等分為25個(gè)中方格。每個(gè)中方格又分16個(gè)小方格，通常我們?nèi)∷慕堑?個(gè)中方格和中間的1個(gè)中方格來(lái)計(jì)數(shù)紅

5、細(xì)胞。首先用吸管吸取少許稀釋后的單細(xì)胞懸液，從蓋片端滴一小滴（不宜過(guò)多），液體自行向內(nèi)滲入，靜置數(shù)分鐘后，再放在微鏡下觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，若細(xì)胞位于小方格的線上，應(yīng)遵循“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則，以減少誤差。計(jì)數(shù)應(yīng)重復(fù)3次，取其平均值。數(shù)完畢后，依下式計(jì)算：每1mL白細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)＝（4個(gè)中方格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)每1mL紅細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)＝（80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/80）×400×104×稀釋倍數(shù)