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1、《飼料工業(yè)》·2006年第27卷第20期生物技術產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定吳敏峰耿秀蓉祝小潘康成摘要采集健康奶牛的新鮮糞便,利用剛果紅平板染色法分離篩選具有產(chǎn)纖維素酶活性的芽孢桿菌,并進行細菌菌落、形態(tài)和生化鑒定。結果從牛糞中分離出35株兼性厭氧的芽孢桿菌,利用剛果紅鑒別培養(yǎng)基篩選出具有分解纖維素能力的菌株,并測定其水解圈大小,初步篩選出10株纖維素酶高產(chǎn)菌株,并對其進行了種屬鑒定:一株為梭狀芽孢桿菌,其余9株為芽孢桿菌屬細菌。關鍵詞纖維素酶;芽孢桿菌;分離;鑒定中圖分類號Q814.1纖維素是植物體的主要成
2、分,是地球上數(shù)量最大0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、的可再生性能源物質,利用微生物可將纖維材料轉化L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05%、NaCl0.5%、無水乙酸鈉為飼料、化工等原料。隨著能源緊張、環(huán)境污染和人口0.3%、CaCO30.1%、NaHCO30.1%、K2HPO40.4%、Mg-劇增等世界性問題的日趨嚴重,對綠色生態(tài)的呼聲越SO4·7H2O0.05%、(NH4)2SO40.1%、MnSO4·H2O0.02%、來越高,因此,通過可再生纖維素資源的生物轉化生瓊脂粉1%、水1000m
3、l,pH值為7.0。[4,5]產(chǎn)葡萄糖和乙醇已成為一個十分重要的熱門課題。而1.1.2.3CMC-Na培養(yǎng)基CMC-Na1%、蛋白胨這一應用的首要前提就是要分離到能夠高產(chǎn)纖維素0.5%、酵母膏0.05%、KH2PO40.15%、MgSO40.02%、酶、有效分離纖維素的微生物菌種。目前研究較多的NaCl0.5%、瓊脂粉0.8%,pH值為7.0。是霉菌,其中木霉、曲霉、根霉和青霉具有較強的酶活1.1.3試劑及溶液力,尤以綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉為典型,是目0.2%剛果紅染液、5%醋酸、1mol/lNaCl。
4、[1]前公認的較好的纖維素酶生產(chǎn)菌。但霉菌為好氣性1.2方法微生物,而飼料發(fā)酵、污物的纖維素類分解等都是在1.2.1細菌分離少氧或缺氧環(huán)境中進行的,故產(chǎn)纖維素酶活高的厭氧取新鮮糞便5g于95ml滅菌生理鹽水中,振蕩及兼性厭氧細菌更具有應用上的現(xiàn)實意義。出芽孢的搖勻,置于80℃水浴10min。按1%接種量接種于增細菌因芽孢的形成,在耐酸、耐堿、耐高溫等方面有明菌肉湯中,37℃厭氧培養(yǎng)48h。取增菌培養(yǎng)后的菌液顯的優(yōu)勢,更利于實際操作和工業(yè)生產(chǎn),因此成為目于分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),置于厭氧缸中,37℃培養(yǎng)+前研究產(chǎn)
5、纖維素酶微生物的一個重要方向。48h后,挑取單個菌落染色鏡檢,取G芽孢桿菌繼續(xù)1材料和方法純化培養(yǎng)。1.1材料1.2.2纖維素分解菌的篩選及纖維素酶活力的初步[6-8]1.1.1樣品采集測定從四川農大奶牛場采集健康奶牛新鮮糞便。將分離到的各純化菌種活化,在CMC-Na平皿上[2,3]1.1.2培養(yǎng)基以3點種植,分別培養(yǎng)24、48h后,采用0.2%剛果紅1.1.2.1液體增菌培養(yǎng)基胰蛋白胨1%、酵母粉染色30min,然后依次用蒸餾水和1mol/l的NaCl徹0.3%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.
6、1%、底洗去染液,再用5%(m/v)的醋酸固定顏色。在菌落L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05%、NaCl0.5%、無水乙酸鈉周圍形成染色圈的菌落證明芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶。用0.3%、水1000ml,pH值為7.0。游標卡尺分別測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C),選1.1.2.2菌種純化培養(yǎng)基胰蛋白胨1%、酵母粉擇兩者比值(H/C)較大的10株菌株進行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察及生理生化鑒定。1.2.3生理生化鑒定吳敏峰,四川農業(yè)大學動物科技學院,625014,四川雅安。耿秀蓉,四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所。各種生長、生
7、理生化試驗均以培養(yǎng)20~24h的斜祝小、潘康成(通訊作者),單位及通訊地址同第一作者。面為種子。收稿日期:2006-07-10除特別說明外,一般形態(tài)學觀察和生理生化性狀21生物技術吳敏峰等:產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離鑒定[9]試驗均參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第9版和《微生從牛糞便中篩選到的芽孢桿菌共35株,將純化[10,11]物學實驗》進行屬和種的鑒別。的菌種點種于纖維素平板上,經(jīng)剛果紅染色,篩選出芽孢桿菌主要分5個屬,用形態(tài)學觀察、接觸酶產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌17株,經(jīng)多次反復試驗比較,試驗、硫酸鹽還原試驗和需
8、氧性試驗可以鑒定到屬,得出其水解圈大小。各屬依靠碳水化合物發(fā)酵和生化特性可以鑒定到種。根據(jù)剛果紅染色結果,初步篩選出A1、B3、C、D2、2結果與分析D3、E1、E2、E3、F、M10株具有較高纖維素分解能力的芽2.1纖維素酶分解菌的篩選及測定結果(見表1)孢桿菌,對其進行生理生化鑒定。2.2形態(tài)學觀察及生理生化鑒定結果表1纖維素酶分解菌剛果紅染色結果2.2.1形態(tài)學觀察菌種編號C(cm)H(cm)
