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1、曲霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立研究生導(dǎo)師學(xué)院Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus21.研究背景2.研究目的3.實(shí)驗(yàn)路線4.第一部分曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)與DNA提取5.第二部分曲霉菌FQ-PCR檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià)6.結(jié)果與討論7.全文結(jié)論目錄3研究背景4研究背景曲霉菌屬(aspergillus)：屬絲狀真菌，是一種常見(jiàn)的條件致病性真菌，好發(fā)于免疫低下及缺陷的人群在免疫缺陷、
2、惡性腫瘤、器官移植患者中的感染率呈上升趨勢(shì)YuY,AmJperinatol,2013MelladoE.RevlberoamMicol,2013Armstrong-JamesD.Trendsinmicrobiology,2014KauffmanCA.Fungalinfections.2013研究背景地方性真菌1%地方性真菌3.5%1990年-1999年2000年-2008年leukemiapatients,M.D.AndersonCancercenter,CID,2010,50:405-15楊尚倫.急性淋巴細(xì)胞白血病
3、真菌感染臨床特點(diǎn)分析[J].實(shí)用癌癥志,2014(9):1182-1184.2008年-2013年6研究背景侵襲性曲霉菌?。↖nvasiveAspergillosis,IA）：是感染曲霉菌所引起的一種慢性霉菌病最常見(jiàn)的致病性曲霉菌：煙曲霉菌、黃曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌ArvanitisM.ClinicalInfectiousDiseases,2015Kwon-ChungKJ.PLoSPathog.20137研究背景培養(yǎng)直接涂片鏡檢影像學(xué)GM實(shí)驗(yàn)組織病理FQ-PCR曲霉菌輔助檢查方法直接涂片和培養(yǎng)陽(yáng)性率低取材有創(chuàng)、困
4、難真菌感染診斷的研究熱點(diǎn)缺乏特異性，特征性表現(xiàn)出現(xiàn)晚靈敏性、特異性高，但易受影響，出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性FQ-PCR技術(shù)在病毒感染的診斷檢查技術(shù)方面已經(jīng)成熟目前沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的用于臨床的曲霉菌FQ-PCR檢測(cè)試劑盒（CFDA檢索）前期已成功建立了念珠菌及新型隱球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系8研究背景LauAMethodsMolBiol,2013AittakorpiA.Journalofclinicalmicrobiology,2012建立曲霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，關(guān)鍵在于曲霉菌DNA的提取和特異性引物探針的設(shè)計(jì)研究背
5、景10研究背景曲霉菌DNA提取方法史俊艷.臨床常見(jiàn)曲霉菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究[D].中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2010.Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,201111研究背景曲霉菌DNA提取方法的選取物理方法液氮研磨法：次之，已有商品化試劑盒玻璃珠機(jī)研磨法：最佳，但耗時(shí)長(zhǎng)超聲波降解法化學(xué)方法CTAB緩沖液加微波法酶消化法：快速有效高滲震擾法Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011RittenourWR.JournalofEnvironm
6、entalMonitoring,2012O'ConnorL.US20110311969[P].2011理論18SrDNA、28SrDNA、5.8SrDNA、ITS1、ITS2實(shí)際A.fumigatuseasLgene、A.flavusaflEgene、A.terreusCBMAI0193gene、A.nigeralpha-1,3-glucansynthasegene研究背景GadeL,EukaryotCell,2013OgawaM.GraefesArchClinExpOphthalmol,2012RobinsonS
7、L.Mycologia,2012YuquanX.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013擴(kuò)增靶序列的選取1.探針不保守2.引物Tm值不達(dá)要求13初步設(shè)計(jì)合成的四種曲霉菌引物探針序列（每種2套）菌種引物探針序列Tm值(℃)A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.fumigatus2F：AGCCTCGGGATGTGGTTC
8、AP：CTGGACCCATGACCAATCTTCTGTGTGR：TCGTCGGTCACTTTCCTTGC61.963.362.5A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164.660.3A.flavus2F：ATC
