流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定溶菌酶含量.pdf

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1、第39卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究簡(jiǎn)報(bào)第7期2011年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry11O0～l103DOl：10．3724／SP．J．1096．2011．O1100流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定溶菌酶含量嵇正平王俊韓靜胡效亞(揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，食品化學(xué)研究所，揚(yáng)州225002)摘要基于溶菌酶催化水解殼聚糖的產(chǎn)物氨基葡萄糖，與金溶膠一魯米諾可產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光，建立流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光測(cè)定溶菌酶含量的方法。對(duì)水解和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，pH4．0、50

2、℃水解5h為最佳水解條件。在金膠、魯米諾及NaOH的濃度分別為0．05，0．05和10mmol／L條件下，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)效果最好。在優(yōu)化條件下，溶菌酶濃度在5～800g／L范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為4g／L。本方法可用于蛋清中溶菌酶含量的檢測(cè)。關(guān)鍵詞化學(xué)發(fā)光；溶菌酶；殼聚糖；魯米諾1引言溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，廣泛存在于植物、鳥類、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌等生物體內(nèi)及分泌物中。作為一種動(dòng)物體內(nèi)在的抗體，它可以通過溶解細(xì)菌尤其是革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁，阻止細(xì)菌的入侵。因此，溶菌酶常被用作

3、肉類、奶酪、蔬菜和新鮮水果等物品的防腐劑，也有一些文獻(xiàn)報(bào)道了其作為抗感染和潰瘍藥物的應(yīng)用]。溶菌酶的使用存在一些爭(zhēng)議，因?yàn)橛袀€(gè)案研究顯示，溶菌酶會(huì)導(dǎo)致過敏]。所以，研究溶菌酶的檢測(cè)方法很有意義。目前，檢測(cè)溶菌酶的方法有免疫檢測(cè)法】、分光光度法、HPLC法[5]、質(zhì)譜法及熒光法等?；瘜W(xué)發(fā)光法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，其中應(yīng)用最廣泛的是魯米諾體系~。。Zhang等報(bào)道的納米金屬材料催化魯米諾化學(xué)發(fā)光體系，可用于含氨基化合物的檢測(cè)[1。其化學(xué)發(fā)光機(jī)理為：納米金屬材料催化溶解氧氧化含氨基的螯合劑生成HO：

4、，進(jìn)而氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。此基礎(chǔ)上，本研究利用溶菌酶催化水解殼聚糖，產(chǎn)生氨基葡萄糖，再被納米金一魯米諾化學(xué)發(fā)光體系所檢測(cè)，建立了溶菌酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)新方法。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器與試劑IFFM—E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)；Tecnai一12(120KV)透射電鏡(飛利浦公司)；PHs一25型數(shù)顯pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。20mg／L溶菌酶儲(chǔ)備液：將20mg溶菌酶(二次結(jié)晶，活力≥20000．0U／mg)溶于水，定容至1000mL，4℃冷藏備用；l％殼聚糖儲(chǔ)備液：稱取10．00g殼

5、聚糖(1．5×10kDa)溶于1000mL醋酸(1％)一醋酸鈉(1％)緩沖液中；10mmol／L魯米諾(陜西師范大學(xué))儲(chǔ)備液；1％檸檬酸鈉溶液；0．2mmol／L氯金酸溶液；0．1mol／LNaOH；0．1mol／LHC1，以上試劑為分析純，本實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。2．2金膠的制備采用文獻(xiàn)[18]的方法，將100mL氯金酸溶液加熱至沸，在劇烈攪拌下迅速加入3．00mL檸檬酸鈉溶液，攪拌條件下回流15min，去掉熱源繼續(xù)攪拌10min，得粒徑為19nm的納米金膠。將制得的金膠冷卻至室溫，放于冰箱(4℃)中備用。通過

6、改變檸檬酸鈉溶液的加入量，可以制得不同顆粒的金膠。2010-1卜25收稿；201卜03一l5接受本文系863計(jì)劃專題項(xiàng)目(No．2009AA03Z331)資助E—mail：xyhu@yzu．educa第7期嵇正平等：流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)溶定菌酶含量2．3殼聚糖的水解分別移取殼聚糖儲(chǔ)備液2．00mL，再加入不同量溶菌酶溶液，用HC1或NaOH調(diào)至pH一4．0，稀釋至50．00mL，50℃恒溫水解5h得水解樣。同時(shí)，制得不加溶菌酶的樣品空白。2．4化學(xué)發(fā)光檢測(cè)流動(dòng)注射發(fā)光裝置如圖l所示，樣品空白c與水解樣s通過換向閥交

7、替進(jìn)入管路，再與堿性魯米諾溶液R(0．05mmol／L魯米諾+20mmol／LNaOH)混合，混合液在化學(xué)發(fā)光池與金溶膠R2(0．05mmol／L)接觸，化學(xué)發(fā)光訊號(hào)被光電倍增管PMT檢測(cè)。記錄發(fā)光強(qiáng)度與時(shí)間的關(guān)系曲線，根據(jù)峰值高度計(jì)算溶菌酶含量。各管路流量均為2．0mL／min，流通管內(nèi)徑2mm。樣品罕臼，、Sampleblank水解樣SampleJl光電倍增管f魯米LinolR兒。IPhotomultiplierlumtubeI金溶膠dsR2Goldcolloi圖1流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光檢測(cè)示意圖Fig．1Schem

8、aticdiagramofCLflowsystem3結(jié)果與討論3．1水解條件改變殼聚糖儲(chǔ)備液的體積，并于不同的水解時(shí)間取樣進(jìn)行分析。結(jié)果表明，隨著殼聚糖用量增加、水解時(shí)間的增長(zhǎng)，被檢出的化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)。當(dāng)殼聚糖體積大于2mL、水解時(shí)間達(dá)5h，發(fā)光強(qiáng)度變化較緩。過大的殼聚糖體積及過長(zhǎng)的時(shí)間均導(dǎo)致基線的噪音過大。本研究中殼聚糖體積選擇為2mL、水解時(shí)間為5h?？疾?/p>