重組質粒的構建.doc

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1、重組質粒構建生物學——屠仁軍(新浪)一、載體與外源片段（PCR產(chǎn)物）的雙酶切為了保證做連接反應時有足夠的外源DNA片段，應該加入1ug的DNA進行酶切反應；兩種酶分別加1ul，10×buffer2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑膠分析DNA以及載體的濃度，取1-2ul，電泳檢測其含量。1ul體積太少，可以將其稀釋在9ul水中，再加loadingbuffer。6ul15000bp的marker，2500bp條帶的亮度約是100ngDNA?？蓪Ρ萴arker的亮度算出酶切回收的DNA的濃度，以便于確定連接反應時

2、的用量。ImageJ軟件可以做灰度分析。）雙酶切反應結束后，使用PCRcleanup試劑盒回收DNA與載體?；厥胀曛笥猛瑯拥姆椒ǚ治銎錆舛?。（也可以用分光光度計直接測量DNA的濃度，但是，一般酶切反應之后其濃度會比較小，取1ul?稀釋100倍之后濃度很低，可能已經(jīng)低于儀器的測量范圍，而電泳靈敏度很高，還可一排除雜帶、RNA、蛋白質等對濃度的干擾。）二、連接反應載體100ng，DNA片段根據(jù)大小，1ulbuffer，1ulT4連接酶，加水至10ul；16℃連接12-16h。載體（約0.03pmol）與外源DNA的摩爾比大約

3、1：3-1：10之間，根據(jù)載體與DNA片段的長度，可算出需要的量。因為載體的大小一般在5kb-10kb，因此，嚴格的算出0.03pmol的載體的質量意義不大，大約100ng即可。如果時間比較緊張，可以25℃連接15min，之后可取5ul進行轉化，剩余5ul于16℃繼續(xù)連接。三、質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌中從-70℃中取出感受態(tài)，指尖輕轉融化后立即插入冰上，5ul連接產(chǎn)物+100ul感受態(tài)大腸桿菌，充分混勻后冰浴30min，然后42°熱激90s，熱激時不要晃動EP管。然后立即插入冰上，靜置2min。（連接產(chǎn)物的量盡量不超過感受

4、態(tài)體積的5%，否則會降低轉化效率，從而得不償失。）在超凈臺中向EP管中加入700ul無抗性LB培養(yǎng)基，然后37℃搖床培養(yǎng)45min-1h；4000rpm離心3min，在超凈臺中棄去700ul上清，然后輕輕吹打殘留的菌液沉淀，涂平板；（涂平板的玻璃棒要在酒精燈上燒熱滅菌，后冷卻）37℃培養(yǎng)箱先正放15min，之后倒置培養(yǎng)12-16h。（超過16h，則陽性克隆周圍會生出衛(wèi)星菌落，原因是陽性克隆會分泌水解氨芐的酶到培養(yǎng)基中，水解其周圍的氨芐，因此，平板上的DH5α、雜菌等會生長。）四、重組子的挑取培養(yǎng)挑選單克隆到2mlLB培養(yǎng)基

5、中，37℃培養(yǎng)8-16h，可提質粒。（要在管壁上部用注射器的針頭燒熱，戳個小洞，因為大腸桿菌是好氧的，無菌會生長緩慢）其實在挑克隆培養(yǎng)的時候就可以PCR鑒定，先配好PCR反應體系，在超凈臺中，同一個克隆，一半用于搖菌培養(yǎng)，一半用小的槍頭挑取在對應的PCR體系里涮一下，即可作為模版進行PCR反應。PCR時要做陰性、陽性對照。陰性對照，用槍頭在沒有菌落的培養(yǎng)基上沾一下做模版（PCR靈敏度很高，要排除連接體系中的殘留的DNA對結果影響的可能），陽性對照用最初PCR擴增DNA片段時的模版。也可以等37℃培養(yǎng)8-16h之后取1ul菌

6、液做模版鑒定，或者提質粒之后，用質粒做模版進行鑒定，均可。五、質粒的提取與電泳檢測1.?在超凈臺中取300ul菌液與無菌EP管中，4℃保存，待鑒定是否成功后取100ul菌液+100ul50%甘油保種，送200ul菌液到公司測序，不正確的丟掉即可。（如果質粒量很多，也可以送5-10ul質粒測序）2.取1ml菌液到新的EP管,12000rpm離心30s，棄上清，再將700ul剩余菌液于同一EP管，12000rpm離心30s，棄上清。然后瞬時離心，將殘留液體吸干。（槍頭不能重復使用）3.加入預冷的200ul溶液I(4℃低溫保存)

7、。反復吹打混勻。（一定要混勻，不然會影響裂解效果，可以用渦旋混合器震蕩混勻）4.加入200ul溶液II，蓋緊管口，輕輕快速顛倒離心管3-5次。（不要劇烈震蕩，防止基因組DNA、質粒斷裂，可以懸空加試劑，這樣不用換槍頭，而且比較快，下同）5.?觀察到溶液變清后，立即加入預冷的200ul?溶液III。顛倒3-5次，顛倒時用手指輕彈離心管底部，混勻。冰浴5min。12000rpm離心10min。6.取400ul上清至另一干凈的離心管中（盡量不要吸到白色的沉淀物質，如果效果不理想，可以轉移400ul上清至新離心管，12000rpm

8、，5min，之后在轉移上清），加入500ul異丙醇，充分混勻。室溫放置2min，12000rpm離心10min。7.?棄上清，加入700ul75%的乙醇，輕輕顛倒兩次，12000rpm離心5min，重復操作一次。8.棄上清，然后瞬時離心，用Tip頭將殘留酒精吸干?？諝庵懈稍?0min。9.加入50-10