黑曲霉發(fā)酵檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控.doc

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1、黑曲霉發(fā)酵檸檬酸合成途徑與代謝調(diào)控摘要:檸檬酸是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的重要有機(jī)酸,用途極為廣泛。我們廠檸檬酸發(fā)酵采用的是黑曲霉深層發(fā)酵技術(shù)，所以對(duì)黑曲霉發(fā)酵的過(guò)程的了解和分析有利于我們實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵的控制和對(duì)發(fā)酵現(xiàn)在出現(xiàn)的問(wèn)題從根本上找到解決的途徑。關(guān)鍵詞:檸檬酸;黑曲霉合成途徑;黑曲霉代謝調(diào)控發(fā)酵有機(jī)酸以檸檬酸為主,它占酸味劑市場(chǎng)的70%左右。檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一?；瘜W(xué)名稱2-羥基丙三羧酸，英文文獻(xiàn)俗名citricacid，分子式C6H8O7。無(wú)色或白色晶體，無(wú)臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸

2、性反應(yīng)。一、檸檬酸發(fā)酵菌黑曲霉積累檸檬酸的機(jī)理1、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑上面的生物反應(yīng)可以通過(guò)化學(xué)方程式來(lái)表示：（1）C6H12O6→2CH3COCOOH+2ATP+2NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）葡萄糖通過(guò)酵解生成分子的丙酮酸（2）CH3COCOOH+CO2+ATP→C4H4O5+ADP+Pi丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下氧化脫掉一個(gè)COOH（羧基）生成草酰乙酸（3）CH3COCOOH＋CoA＋NAD＋→CH3C0-CoA＋NADH＋＋CO2丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下脫氫生成乙酰coa（即活化的乙酸：CH3COOH）（4）C4H4O5+CH3C

3、OOH→C6H8O7草酰乙酸和乙酰coa縮合成為檸檬酸黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸,其生物合成途徑現(xiàn)普遍認(rèn)為是:葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA,另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)生成草酰乙酸,草酰乙酸與CoA縮合生成檸檬酸。(1)生長(zhǎng)期與產(chǎn)酸期都存在EMP與HMP途徑，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1(2)黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵時(shí)，當(dāng)檸檬酸積累時(shí)，TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱。(3)由于TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或

4、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由兩個(gè)CO2固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸為主。二、黑曲霉檸檬酸發(fā)酵的代謝調(diào)控檸檬酸是TCA中一員,是許多組織和微生物中廣泛存在的一種重要有機(jī)酸,它不僅為許多微生物利用同化,而且是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子。通常微生物細(xì)胞中合成的檸檬酸進(jìn)一步經(jīng)TCA循環(huán),生物合成其他有機(jī)酸,提供合成細(xì)胞物質(zhì)的中間體或徹底氧化產(chǎn)生能量,為細(xì)胞活動(dòng)和耗能合成代謝提供能量。因此正常生長(zhǎng)的細(xì)胞中檸檬酸是不會(huì)過(guò)量積累的。而黑曲霉積累檸檬酸受到四個(gè)方面的調(diào)節(jié):糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)和Mn2+調(diào)節(jié);三羧酸循環(huán)

5、的調(diào)節(jié);O2的調(diào)節(jié)。（1）、糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)1、磷酸果糖激酶（PFK）：Mn2+濃度對(duì)磷酸果糖激酶的影響.當(dāng)培養(yǎng)基中Mn2+缺乏時(shí)，微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高。2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脫氫酶：催化生成乙酰CoA。（2）三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)1、檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)：檸檬酸合成酶是TCA循環(huán)第一個(gè)酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。2、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調(diào)

6、節(jié)：順烏頭酸水合酶是催化檸檬酸<>順烏頭酸<>異檸檬酸正逆反應(yīng)的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時(shí)能建立下面的平衡：檸檬酸:順烏頭酸:異檸檬酸＝90:3:7。順烏頭酸水合酶、NAD和NADP-異檸檬酸脫氫酶在檸檬酸產(chǎn)生與不產(chǎn)生時(shí)，這3種酶均存在，而當(dāng)銅離子0.3mg/L，鐵離子2mg/L和pH2.0情況下，這3種酶均不出現(xiàn)活力，發(fā)酵中檸檬酸正是在這個(gè)pH條件下積累的。3、α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)在黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中，TCA循環(huán)的一個(gè)顯著特點(diǎn)是，α-酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當(dāng)以葡萄糖為碳

7、源時(shí)，在檸檬酸生成期，菌體內(nèi)不存在α-酮戊二酸脫氫酶或活力很低。α-酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)是TCA循環(huán)中唯一不可逆反應(yīng)，一旦α-酮戊二酸脫氫酶喪失，就會(huì)引起：①TCA循環(huán)中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循環(huán)生成，使TCA循環(huán)成“馬蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。(3)氧對(duì)檸檬酸積累的調(diào)節(jié)乙酰CoA和草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸過(guò)程中要引進(jìn)一個(gè)氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用為：(1)氧是發(fā)酵過(guò)程生成的NADH2重新氧化的氫受體。(2)近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉中除了具有一條標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈以外，還有

8、一條側(cè)系呼吸鏈。當(dāng)缺氧時(shí)，只要很短時(shí)間中斷供氧，就會(huì)導(dǎo)致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。