《酶的分子修飾》PPT課件.ppt

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1、第五講酶分子修飾講課：陽飛系部：生化系作業(yè)?第五講酶分子修飾教學(xué)目標(biāo)：了解有關(guān)酶分子修飾的重要應(yīng)用以及酶分子的物理修飾作用理解蛋白酶化學(xué)修飾的方法和意義掌握酶分子化學(xué)修飾的形式、目的、原理與特點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：酶分子化學(xué)修飾的方法和意義、酶分子化學(xué)修飾的形式教學(xué)難點(diǎn)：化學(xué)修飾的原理與特點(diǎn)第五講酶分子修飾5.1、酶分子修飾的定義及其意義5.2、酶分子修飾方法5.3、酶修飾后的性質(zhì)變化5.4、酶的分子定向進(jìn)化分析酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用受到極大限制的原因？熱穩(wěn)定性差活力低耐受pH范圍窄分子量過大成本高來源有限有異體反應(yīng)？酶

2、的應(yīng)用受到了很大限制促使科研工作者必須不斷地開展新的研究，用化學(xué)或分子生物學(xué)方法對酶分子進(jìn)行改造，以滿足各種反應(yīng)條件對酶的需求，克服天然酶的缺陷。隨著各個(gè)學(xué)科及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，特別對酶結(jié)構(gòu)與功能的深入了解、基因工程及固定化技術(shù)的普及，酶的分子改造工程進(jìn)入實(shí)用階段?？傮w來說酶的分子工程分兩部分：★分子生物學(xué)水平：即用基因工程方法對DNA進(jìn)行分子改造，以獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)更合理的酶蛋白；★對天然酶分子進(jìn)行改造：包括酶一級結(jié)構(gòu)中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側(cè)鏈修飾等。5.1、酶分子修飾的定義及其意義1、定義：通過各種方

3、法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程。即在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。討論:自然界中存在酶分子改造修飾嗎？酶原激活可逆共價(jià)調(diào)節(jié)？胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原磷酸化酶a與磷酸化酶b互變2、酶分子修飾的意義增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（stability）提高酶的活力（activity）降低或消除酶的抗原性（immunologicalproperty）研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子

4、和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象（structure）的影響3、酶分子修飾的基本要求和條件（1）對酶性質(zhì)的了解：①酶的穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、抑制劑等②酶活性中心的狀況：活性中心基團(tuán)、輔因子以及分子大小、性狀、亞基數(shù)（2）對修飾劑的要求：①良好的生物相容性和水溶性②修飾劑的相對分子質(zhì)量（較大）、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附性③修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置④修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件（3）對酶反應(yīng)條件的選擇：①反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例②反應(yīng)體系中的溶劑性質(zhì)、鹽濃度和pH條件③反應(yīng)溫度及時(shí)間5.

5、2、酶分子的修飾方法物理修飾：不改變酶的組成單位及其基團(tuán)的修飾，即酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素（高溫、高壓、高鹽、極端pH值）作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排?；瘜W(xué)修飾：★廣義:指凡涉及共價(jià)部分或部分共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變?！铼M義:指在較溫和的條件下以可控的方式使一種蛋白質(zhì)與某些化學(xué)試劑起特異反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或其功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化。一、影響酶分子化學(xué)修飾的主要因素1、酶蛋白功能基團(tuán)的反應(yīng)性蛋白質(zhì)功能基團(tuán)所處的環(huán)境會強(qiáng)烈地影響它的物理和化學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的表面特點(diǎn)也影響化學(xué)試

6、劑的接近因此，有必要考察局部衡區(qū)對功能基和修飾劑的影響。由于功能基的反應(yīng)性是通過它的親核性來測量的，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)pKa和影響pKa的因素。2、修飾劑的反應(yīng)性1、影響酶蛋白功能基團(tuán)的反應(yīng)性因素①微區(qū)的極性②基團(tuán)間的氫鍵③靜電效應(yīng)④位阻效應(yīng)⑤其它電荷轉(zhuǎn)移、共價(jià)鍵形成、金屬螯合、旋轉(zhuǎn)自由度①微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。極性對整個(gè)反應(yīng)速度影響與反應(yīng)的類型有密切關(guān)系。從整體看來，局部極性的改變對色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反應(yīng)性的影響較小對氨基和組氨酸反應(yīng)性的影響較大對酪氨酸、半胱氨酸和羧基的反應(yīng)性

7、影響最大②基團(tuán)間的氫鍵作用在蛋白質(zhì)的酚基-羧基相互作用中，羧基的pKa應(yīng)比正常值低，而酚基的pKa高于正常值。+H+③靜電效應(yīng)用高分辨率的核磁共振組氨酸殘基的電離行為進(jìn)行研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pKa是不同的；原因可能在于帶電基團(tuán)相互靜電作用的影響。④位阻效應(yīng)烷基在空間上緊靠功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。對枯草桿菌蛋白酶BPN的X射線衍射研究指出：10個(gè)酪氨酸殘基均在蛋白質(zhì)分子表面，而且苯酚的羥基幾乎在所有情況下都沒有形成氫鍵。對它進(jìn)行徹底硝化和碘化后，10個(gè)酪氨酸中只有8個(gè)

8、被修飾。若沒有X射線衍射研究結(jié)果，很可能解釋為至少有2個(gè)酪氨酸殘基被包埋在分子內(nèi)部，但實(shí)際情況并不是這樣的，這種情況很可能是空間障礙引起的?！镄D(zhuǎn)自由度加快修飾反應(yīng)速度的一個(gè)重要原因是限制了構(gòu)象的總數(shù)(即限制了旋轉(zhuǎn)自由度)，這種限制可能是由于上述提及的幾類相互作用引起的。酚酸的酯化速度：在苯環(huán)上引入幾個(gè)甲基，特別是在同一碳原子上引入2個(gè)甲基，則限制了基團(tuán)的自由旋轉(zhuǎn)，因而使酚酸的酯化速度常數(shù)提高了108倍以上。2、