MDCK細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng).doc

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1、MDCK細(xì)胞培養(yǎng)MEM細(xì)胞生長(zhǎng)液配制500mlMEM液+5ml雙抗（青霉素+鏈霉素）+5mlL■谷氨酰胺+7.5ml碳酸氫鈉+50ml小牛血清90%MEM液1%雙抗1%L?谷氨酰胺1.5%碳酸氫鈉10%小牛血清0.25%EDTA月夷酶（從冰箱取出后放入培養(yǎng)箱屮待用）（1）細(xì)胞傳代將細(xì)胞瓶屮的生長(zhǎng)液倒去，加入MEM液（大概6ml左右）清洗，倒去；加入EDTA■肺酶（根據(jù)細(xì)胞消化情況而加量），倒去；再加入EDTA■胰酶，放置培養(yǎng)箱，進(jìn)行消化（大概10分鐘左右），待其細(xì)胞開(kāi)始脫落后（在細(xì)胞瓶屮呈毛玻璃）；吸干EDTA■胰酶倒去，放置培養(yǎng)

2、箱一段時(shí)間（細(xì)胞呈逐個(gè)完整），取岀；【細(xì)胞生長(zhǎng)好，多，可1傳3或者1傳4】將配好的細(xì)胞生長(zhǎng)液吸入，吹打混勻，待完全脫落至過(guò)長(zhǎng)液屮；將其分裝入細(xì)胞瓶和細(xì)胞板屮。6ml/瓶37°C培養(yǎng)1ml/孔CO2培養(yǎng)箱（用于標(biāo)本接種）（2）標(biāo)本處理復(fù)融，從?70°C冰箱取出，常溫下溶解；充分震蕩，后取出試導(dǎo)，至4C冰箱屮，靜置20分鐘左右；取螺旋管，在其加入（）.2ml的雙抗（20%）,后加入1.8ml的病毒液，放置4°C,過(guò)夜上毒。（3）細(xì)胞上毒（需培養(yǎng)一周）洗細(xì)胞，將細(xì)胞板（前一天）上的液體（生長(zhǎng)液）吸干，加入1ml的MEM,清洗，重復(fù)一次，

3、然后吸干；加入處理后的病毒液180ul；放置CO2培養(yǎng)箱中1.5ho將細(xì)胞板??；1ml/孑L加入病毒過(guò)長(zhǎng)液后，放置CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)一周；并將上周上毒的細(xì)胞液取出，放置?70°C冰箱，隔天鑒定。配制病毒過(guò)長(zhǎng)液：lOOmlMEM屮加入1ml雙抗，1mlL■谷氨酰胺1mlTPCK-胰酶1.5ml碳酸氫鈉血凝試驗(yàn)：病毒經(jīng)系列稀釋，與一定濃度的紅細(xì)胞混合，混合液放置在專為血凝試驗(yàn)設(shè)計(jì)的板的圓底屮，未出現(xiàn)凝集的紅細(xì)胞可在孔底自由滾動(dòng)，形成濃密的，極易識(shí)別的細(xì)胞團(tuán)，而凝集紅細(xì)胞不能在池底自由滾動(dòng)，均勻地覆蓋池底。(4)1%人O型紅細(xì)胞洗滌首先

4、應(yīng)選擇無(wú)乙肝病毒攜帶者的O型血，待其自然沉降后；吸取紅細(xì)胞層的紅細(xì)胞置入離心管屮；加入無(wú)菌生理鹽水至離心管2/3處，兩管平衡后，1800r/10min；用無(wú)菌吸管吸去生理鹽水，再加入生理鹽水、混勻；重新離心，重復(fù)3次，離心取出后；取細(xì)胞瓶，吸取9ml生理鹽水；加入1ml的離心好的紅細(xì)胞，混勻即可。(5)病毒鑒定將病毒培養(yǎng)(?7O°C的病毒細(xì)胞培養(yǎng)液)取出，常溫下解凍；取鑒定板，將病毒液混勻(2孔合一孔)，滴加3滴病毒液；將洗滌好的1%人O型紅細(xì)胞，滴加3滴；放置lh后，觀察血凝結(jié)果。凝集為陰性，擴(kuò)散為陽(yáng)性，陽(yáng)性吸出病毒液4°C冰箱

5、保存，隔天做效價(jià)試驗(yàn)。(6)病毒效價(jià)測(cè)定(血凝試驗(yàn))從4C冰箱取出前天陽(yáng)性標(biāo)本的病毒液室溫靜置。將病毒培養(yǎng)液，進(jìn)行倍比稀釋：先在A孔中加入lOOul的病毒液;在取50ul生理鹽水依次加入B-H孔屮；以A孔中取出50ul加入B孔中,混勻;依次加入各孔做倍比稀釋，并做生理鹽水對(duì)照；加入1%人O型紅細(xì)胞50ul各孔，混勻靜置lh后觀察;以呈現(xiàn)完全血凝時(shí)的稀釋度為該病毒的最大效價(jià)。(7)病毒血凝抑制試驗(yàn)(病毒種鑒定)(1)將病毒液根據(jù)其效價(jià)做1:8濃度；在1?5列屮，分別加入25ul的A,A3,Bv,By,甲型流感血清抗體；從下孔至上，各

6、加入25ul的生理鹽水；再?gòu)腁排?H排做倍比稀釋，并除去25ul；將稀釋好的病毒液從低濃度到高濃度加入23ul,放置30min,使充分反應(yīng)；(2)效價(jià)冋滴試驗(yàn)(在最后一列做)：先將稀釋好的病毒液取lOOul加入A排；再取50ul生理鹽水滴加入B-H排；從A排中取50ul做倍比稀釋;(3)加入1%人O型紅細(xì)胞50ul各孔，放置lh觀察結(jié)果；先觀察效價(jià)回滴，看稀釋好的病毒液是否在1：8間，如在試驗(yàn)可用，不在試驗(yàn)無(wú)效。判斷：記錄各血清抗體，抑制效價(jià)的最大稀釋度，最大稀釋度效價(jià)結(jié)果可判斷該病毒的血清型。(8)細(xì)胞換液先將細(xì)胞瓶屮細(xì)胞液倒去

7、；加入適量MEM清洗，倒去；配制生長(zhǎng)液加入，放置培養(yǎng)箱即可。(9)細(xì)胞保存先將細(xì)胞瓶屮細(xì)胞液倒去；加入MEM清洗，倒去；后加入EDTA■肺酶，清洗一次，倒去；再加入EDTA-胰酶，放入培養(yǎng)，消化后；吸干細(xì)胞瓶屮液體，放入培養(yǎng)，待其消化好，取出。配制保存液：小牛血清：二甲基亞硯=9:1吸干細(xì)胞瓶屮液體，取1ml保存液吸洗細(xì)胞瓶;待其細(xì)胞充分混入保存液；吸入保存瓶，擰緊，用封口條封好；放入4°C冰箱2h；取出放入?25°C冰箱2h取岀；放入-70-80°C冰箱保存。