資源描述：
《高效快速的點(diǎn)突變方法.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在PPT專(zhuān)區(qū)-天天文庫(kù)。
1、高效快速的點(diǎn)突變方法陳嚴(yán)姜明湯敏謙寶生物工程（大連）有限公司,116600目的：1.在目的基因中的特定位點(diǎn)導(dǎo)入突變，包括：●堿基缺失●堿基置換●堿基插入2.通過(guò)突變基因的表達(dá)，可以為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的分析和改造提供有效途徑。TaKaRa用于定點(diǎn)突變的試劑盒■Mutan-ExpressKmKit■Mutan-SuperExpressKmKit■Mutan-KKit■TaKaRaMutanBESTKitMutan-ExpressKm原理：ODA法E.coliBMH71-18mutS、MV1184CompetentCellorElectroCell導(dǎo)入
2、變異Primer材料與方法MaterialsProtocolReactionMixtureAnnealing/ExtensionDNASampleTransformation（1）E.coliBMH71-18mutSPlasmidMiniprepDNATransformation（2）MV1184ColonySequencingMutan-SuperExpressKm原理：ODA-LAPCR法E.coliMV1184CompetentCellorElectroCellpKF18k/pKF19kDNA導(dǎo)入變異用寡聚核苷酸（5′-P）材料與方法Mat
3、erialsReactionMixturePCR反應(yīng)DNA精制Transformationsup0菌株（MV1184）SequencingColonyProtocolMutan-K原理：Kunkel法材料與方法E.coliBMH71-18mutS、CJ236、MV1184CompetentCellorElectroCell導(dǎo)入變異用寡聚核苷酸M13mp18RForM13mp19RForpUC118/119MaterialsProtocolClonedDNA（M13）TransfectionCJ236ssDNASample變異用寡聚核苷酸5′磷酸化
4、AnnealingExtensionDNASampleTransfectionBMH71-18mutSPhageTransfectionMV1184（ung+Cell）噬菌斑TaKaRaMutanBEST原理：PCR法材料與方法導(dǎo)入變異用PrimerE.coliJM109CompetentcellMaterialsProtocolReactionMixturePCR反應(yīng)電泳回收PCRFragmentBKL反應(yīng)DNASampleTransformation（JM109）SequencingColonyTaKaRaMutanBESTKit使用實(shí)例5′
5、GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG3′3′CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGAC5′pUC118引入點(diǎn)變異區(qū)域堿基序列GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCPrimer1Primer2StepI.PCR反應(yīng)10×PyrobestBufferdNTPMixtrue（各2.5mM）Primer1Primer2TemplatePyrobestDNAPolymerase(5U/ml)滅菌蒸餾水upto5μl4μl0
6、.2～1.0μM(finalconc.)0.2～1.0μM(finalconc.)<1μg0.25μl50μl94℃30sec55℃30sec72℃5min30CyclesPCRFragment10×BluntingKinationBufferBluntingKinationEnzymeMix.ddH2Oupto2μl1μl20μl0.2-20pmolStepⅡ.BluntingKinationReaction37℃，10min.StepⅢ.LigationReactionDNAFragment5μlLigationSolutionI5μl16℃
7、,1hrTransformationJM109ColonySequencing結(jié)果：1.Transformation2.Sequencing挑取10個(gè)藍(lán)色菌落進(jìn)行測(cè)序，證明完全回復(fù)pUC118正常堿基序列，且在其它位置未發(fā)現(xiàn)有變異出現(xiàn)。TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem比較謝謝大家！
