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《實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭染色法、芽孢染色法.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在PPT專區(qū)-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌的革蘭氏染色及芽孢染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。2.鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。3.鞏固無(wú)菌操作技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理：1.革蘭氏染色原理：革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。二、實(shí)驗(yàn)原理：主要因?yàn)閮深惣?xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分不同。G+菌細(xì)胞壁：肽聚糖含量高（90％）、交聯(lián)程度高、肽聚糖層厚、脂類含量少→用乙醇不易脫色；G-菌細(xì)胞壁：肽聚糖含量
2、低（10％）、交聯(lián)程度低，肽聚糖層薄、外壁層脂類含量較高→用乙醇易脫色。2.芽孢染色法原理：二、實(shí)驗(yàn)原理：芽孢是某些G+菌形成的圓形或橢圓形的休眠體，抗熱性和折光性較強(qiáng)。芽孢的大小、形態(tài)、位置可做分類依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)原理：中央芽孢末端芽孢偏端芽孢游離芽孢二、實(shí)驗(yàn)原理：芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難；但當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進(jìn)行染色時(shí)，染料可進(jìn)入菌體和芽孢；進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后可被脫色；當(dāng)用對(duì)比度大、淺色的復(fù)染色劑（番紅）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色（綠色），而菌體呈復(fù)染劑顏色（紅
3、色）。三、實(shí)驗(yàn)器材1.菌株：革蘭氏染色：培養(yǎng)12h-16h枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）或者金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）和培養(yǎng)24h大腸桿菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培養(yǎng)36h的巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）或者枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）2.染色液和試劑：革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫、盧戈氏碘液、95%酒精、番紅復(fù)染液；芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液；二甲苯、香柏油。3.器材：載玻
4、片、接種環(huán)、試管夾、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。三、實(shí)驗(yàn)器材四、實(shí)驗(yàn)步驟1.革蘭氏染色：（1）涂片：涂片方法與簡(jiǎn)單染色涂片相同。（2）干燥：與簡(jiǎn)單染色法相同。（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同。（4）初染：加適量結(jié)晶紫染色液染色1-2min，水洗。（5）媒染：滴加盧戈氏碘液，媒染1min，水洗。四、實(shí)驗(yàn)步驟（6）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無(wú)色，立即水洗。（7）復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染液復(fù)染3min，水洗。（8）干燥：將染好的涂片空氣中晾干或者用吸水紙吸干。（9）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再
5、用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟2.Schaeffer與Fulton氏芽孢染色法（1）涂片：按常規(guī)方法將待檢細(xì)菌制成薄的涂片。（2）干燥：與簡(jiǎn)單染色法相同。（3）固定，與簡(jiǎn)單染色法相同。四、實(shí)驗(yàn)步驟（4）染色：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），用夾子夾住涂片一端，用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時(shí)開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，約維持5-8min。加熱過(guò)程中要隨時(shí)添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。（加熱時(shí)溫度不能太高）。（5）水洗：待玻片冷卻后，用水輕輕地沖
6、洗，直至流出的水中無(wú)染色液為止。四、實(shí)驗(yàn)步驟（6）復(fù)染：用蕃紅水溶液染色2min。（7）水洗：（8）干燥：（9）鏡檢：先低倍，再高倍，最后在油鏡下觀察芽胞和菌體的形態(tài)。。結(jié)果：芽孢呈綠色，菌體為紅色。四、實(shí)驗(yàn)步驟芽孢染色結(jié)果（芽孢呈綠色，營(yíng)養(yǎng)體呈紅色）四、實(shí)驗(yàn)步驟（10）實(shí)驗(yàn)完畢后的處理：①將浸過(guò)油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。四
7、、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、給出（Staphyloccocusaureus和Escherichiacoli的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。2.當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？3.繪圖說(shuō)明你所觀察的Bacillusmegaterium菌體形態(tài)，芽孢的形態(tài)及著生位置。它們各呈什么顏色。4.若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，你認(rèn)為這是什么原因？六、注意事項(xiàng)1、革蘭氏染色注意事項(xiàng)（1）革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過(guò)度，革蘭氏
8、陽(yáng)性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被染成革蘭氏陽(yáng)性菌。脫色時(shí)間的長(zhǎng)短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。（2）染色過(guò)程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。（3）選用幼齡的細(xì)菌。G+菌培養(yǎng)12h-16h，E.coli培養(yǎng)24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽(yáng)性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。2、芽孢染色注意事項(xiàng)（1）供芽胞染色用的菌種應(yīng)控制菌齡。（2）染色
