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《密碼子優(yōu)化的隔孢伏革菌植酸酶基因在畢赤酵母中高效表達(dá)-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、HORIZONOFSCIENCEANDTECHNOLOGYl科技視野密碼子優(yōu)化的隔孢伏革菌植酸酶基因在畢赤酵母中高效表達(dá)陸益新王瑞鯤田永杰吳倩倩李湘鳴(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)[中圖分類號(hào)]$816．79[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1002—8358(2015)12—27—4摘要：本研究目標(biāo)是建立隔孢伏革菌植酸酶(6一既能提高對(duì)磷的利用率，又能減少磷污染。但是，傳phyA)分泌表達(dá)量高的畢赤酵母株，其作為飼料添加劑，可統(tǒng)的植酸酶多數(shù)是3一磷酸植酸酶，耐高溫性差，在促進(jìn)單胃類動(dòng)物消化道對(duì)飼料磷的吸收．減少家畜糞便中磷日常的飼料的加工中．容易被滅活，商業(yè)性植酸酶又對(duì)環(huán)境的污染．又可滿足
2、飼料加工的需要。按照畢赤酵母對(duì)有提純困難、產(chǎn)量低、成本高等特點(diǎn)。隔孢伏革菌植遺傳密碼子的偏好性．利用重疊PCR方法人工合成6一酸酶(Peniophoralycii)是一種6一磷酸植酸酶(6一phyA．將其插入到pPIC9K栽體，構(gòu)建成6一phyA整合型畢phyA)，對(duì)高溫、低pH具有較強(qiáng)的耐受性，故本研究赤酵母表達(dá)載體．通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入GS115酵母細(xì)胞．并篩選通過分子生物學(xué)技術(shù)將隔孢伏革菌植酸酶基因重組出Mut高拷貝轉(zhuǎn)化子。通過SDS—PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在該酵母細(xì)胞克隆株的發(fā)酵液中．見有一明顯6一phi／rA條帶，經(jīng)測(cè)于畢赤酵母中，使得植酸酶基因得到高效表達(dá)，從而表達(dá)產(chǎn)物酶
3、活性．發(fā)現(xiàn)均為對(duì)照酵母株的7．5倍以上，說明有望進(jìn)一步減少磷對(duì)環(huán)境的污染四。6-phvA在所構(gòu)建的畢赤酵母株中成功、有效的表達(dá)。關(guān)鍵詞：隔孢伏革菌植酸酶；畢赤酵母；密碼子偏好1材料與方法1．1隔孢伏革茵植酸酶基因6-phyA的合成磷是動(dòng)物生長、繁殖所必需的營養(yǎng)元素之一，根據(jù)GenBank隔孢伏革菌(Peniophoralycii)植但畜禽常規(guī)植物性飼料中約有60％～80％的磷是以酸酶編碼序列，依據(jù)畢赤酵母所嗜好的密碼子設(shè)計(jì)植酸磷的形式穩(wěn)定存在于植酸鹽復(fù)合物中，這些磷引34條引物．并分別在第一條和第34條引物的5只有在植酸酶的作用下才能被游離出來供畜禽吸端增加SnaBI和No
4、tI酶切位點(diǎn)，利用重疊延伸收利用。但是豬、雞等單胃動(dòng)物消化道中缺乏植酸PCR方法合成隔孢伏革菌植酸酶基因。酶，對(duì)植酸磷的利用能力很低，絕大數(shù)隨糞便排出PCR產(chǎn)物經(jīng)北京天根公司生產(chǎn)的PCR試劑盒體外，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅Ⅲ。同時(shí)，植酸純化。將合成的6-phyA和pUC57用BamHI和磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它與多數(shù)金屬離子及蛋白XholI酶切，用T4連接酶連接，酶切鑒定，測(cè)序，將質(zhì)會(huì)形成不溶復(fù)合物，嚴(yán)重影響動(dòng)物對(duì)其的吸收與其命名為pUC57／6一phyA。利用f2]。如何既滿足動(dòng)物的磷營養(yǎng)需要，又降低飼料1．2人工合成的6-phyA畢赤酵母密碼子嗜好分析成本．減少對(duì)環(huán)境
5、的污染。已成為現(xiàn)今需解決的問將所測(cè)序列遞交http：／／www．genscript．com／cgi-題。目前大量研究表明。在動(dòng)物飼料中添加植酸酶bin／tools／rarecodonanalysis網(wǎng)，對(duì)畢赤酵母(P．P_—astoris)密碼子組成、分布及密碼子的利用頻率進(jìn)行通訊作者：李湘鳴，教授，Email：847264344@qq．con。分析飼料廣角·27科技視野l(fā)HORIZONOFSCIENCEANDTECHNOLOGY1．36一phyA畢赤酵母表達(dá)栽體的構(gòu)建將PCR鑒定正確Mut酵母表型(GS115／L6一以pUC57／6一phyA為模板．PCR擴(kuò)增6-phyA
6、ph)~J線接種YPD培養(yǎng)板上，反復(fù)傳10代后，接種信號(hào)肽下游1230bp的DNA序列，引物設(shè)計(jì)為：上于YPD／G418(5mg／mL)的平板上，30~C培養(yǎng)5-6d，游5一GCTI’ACGTACAATrGCCAATTCCTGCTCAGA使長出直徑3—4mm的克隆。挑取酵母克隆于一3：下游5一AACGCGGCCGCTATYCAGATGGGAC5mLMD培養(yǎng)液中．30℃劇烈振蕩培養(yǎng)18～20h，取GAAACCAC一3．在引物5端分別增加SnaBI和100p~L菌液于lOmL新鮮的BMGY培養(yǎng)液中繼續(xù)NotI酶切位點(diǎn)．并增加3個(gè)保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增程振蕩培養(yǎng)24h，離心收集酵母
7、細(xì)胞，垂懸加入20mL序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性45S，55℃退火培養(yǎng)液BMMY(含l％甲醇)，30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，45S、72~(2延伸2min，進(jìn)行3O個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再每隔24h取2mL樣品測(cè)定植酸酶的表達(dá)活性。每72℃延伸5min．然后進(jìn)入4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒隔24h添加甲醇，使終濃度達(dá)0．5％～l％．于48h后回收純化，命名為L6ph。分別用SnaBI和NotI對(duì)結(jié)束。L6ph和pPIC9K進(jìn)行酶切．酶切產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收1．6．2SDS—PAGE分析純化，用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
