豬流行性腹瀉病毒.doc

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1、豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV）簡介豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)屬于Ⅰ類冠狀病毒，引起豬流行性腹瀉病，仔豬感染此病毒后具有很高的死亡率．PEDV是一個正向包膜病毒，其基因組是正義單鏈RNA5'端有帽結(jié)構(gòu)(cap)，3'端有Poly(A)尾，基因組全長為28033bp，基因組結(jié)構(gòu)如圖所示．5'端的2/3部分編碼2個大的復(fù)制酶多聚蛋白ppla和pplab，其余1/3基因組序列包括5個ORF，編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白

2、:纖突蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)以及ORF3編碼的1個非結(jié)構(gòu)蛋白．復(fù)制周期首先S糖蛋白與受體結(jié)合,然后S糖蛋白被組織蛋白酶L剪切后活化一種融合肽,通過融合肽與細胞內(nèi)成分的融合作用介導(dǎo)病毒侵入宿主細胞。病毒粒子通過膜融合侵入宿主細胞內(nèi),然后釋放其具有感染性的基因組RNA。融合后緊密結(jié)合的病毒RNA與核衣殼蛋白N被釋放進細胞質(zhì)中,隨后在胞質(zhì)中脫衣殼,與核衣殼蛋白N緊密結(jié)合的病毒RNA基因組被釋放入胞質(zhì)中。首先,ORFlab翻譯成一個多聚前體蛋白,然后此前體蛋白被兩種蛋白酶,木瓜樣

3、蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成為對病毒復(fù)制必須的單一蛋白,經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理后產(chǎn)生RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以進入胞質(zhì)中的基因組RNA為模板,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負鏈RNA,然后以負鏈RNA為模板,合成不同長度的亞基因組mRNA(sgmRNA)和基因組RNA,復(fù)制酶、結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白也在這一時期產(chǎn)生。N蛋白與新合成的病毒基因組RNA在細胞質(zhì)中形成螺旋的核衣殼,核衣殼與固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間空隙的M蛋白結(jié)合后再與E蛋白結(jié)合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子

4、出芽,形成包裹的核衣殼。最后,包裹的核衣殼與在高爾基體內(nèi)經(jīng)糖基化等修飾的三聚體S蛋白結(jié)合,形成成熟的病毒粒子,通過胞吐作用釋放到細胞外。一．蛋白組成1.纖突蛋白（Spikeprotein，S）2.小包膜蛋白（Envelopeprotein，E）3.膜糖蛋白（Membraneprotein，M）4.核衣殼蛋白（Nucleocapsidprotein，N）5.ORF3編碼的多肽6.非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructuralprotein）uNsp1uNsp2uNsp3uNsp4uNsp5uNsp6uNsp7uNsp8uN

5、sp9uNsp10uNsp11uNsp12uNsp13uNsp14uNsp157.依賴于RNA的非結(jié)構(gòu)蛋白pol基因編碼（復(fù)制酶多聚蛋白lab，pplab）一．病毒分離方法一病毒粗提從無PED病史的健康母豬場取生后2d的新生仔豬,移入人工哺乳室人工喂奶,觀察2d,4日齡時口服華株病毒,24h左右發(fā)病(水瀉、部分豬嘔吐)。撲殺病豬,取出小腸,輕輕擠去內(nèi)容物,將其縱向剪開,刮取小腸粘膜混合之,用pH7.4的0.01mol/LPBS(含0.15mol/LNaCl,1mmol/LEDTA-Na2)作1∶10稀釋,反復(fù)凍融

6、3次,7000×g離心30min,取上清,加PEG-6000(40%)和NaCl至終濃度分別為6%和2%,4℃過夜后,7000×g離心30min,取沉淀,以PBS懸浮12h以上。將重懸液15000×g離心30min,取上清,140000×g4℃超速離心120min,以PBS重懸沉淀,重復(fù)差速離心1～2輪次。將沉淀用少量PBS充分懸浮,即得粗提病毒。病毒精提將病毒粗制劑進行蔗糖(15%～55%)密度梯度離心,100000×g離心2h。以長彎針頭自下而上吸取各帶少許,電鏡觀察純度,并用紫外分光光度計測定抗原蛋白濃度,

7、用ELISA測定病毒效價。取純度高、活性強的樣品,對PBS或Tris-HCl-EDTA(TE)透析48h,即得病毒純化制劑,作為免疫和檢測用抗原方法二取病死豬腸系膜淋巴結(jié)和己脫落的腸黏膜剪碎，置于無菌的研缽中，滴加5-10倍體積的生理鹽水，反復(fù)研磨20min，反復(fù)凍融3次后轉(zhuǎn)入EP管中加入青霉素(1000U/mL)鏈霉素(300U/mL)37℃水浴1h;之后經(jīng)4000r/min離心30min，取上清用0.22um的濾膜過濾之后用滅菌的EP管收集或直接取0.6mL接種在含有10%血清的MEM培養(yǎng)液中己長成單層的PK

8、-15細胞，每隔6-l0h觀察細胞病變。二．疫苗研發(fā)1.滅活疫苗（組織滅活疫苗和細胞滅活疫苗）優(yōu)點：組織滅活苗效果好，應(yīng)用最為廣泛，細胞滅活苗制備方便，應(yīng)用也越來越廣泛缺點：滅活苗產(chǎn)生完全免疫力需要2周時間，且劑量偏大，安全性2.細胞弱毒苗可應(yīng)用PEDV細胞弱毒苗經(jīng)口免疫晚期妊娠母豬，從而有效預(yù)防PEDV感染3.乳酸桿菌疫苗（S基因）綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生