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《生物制品學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告----三價(jià)副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗(yàn).doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、三價(jià)副豬嗜血桿菌油乳劑滅活疫苗的制備及檢驗(yàn)副豬嗜血桿菌是豬格拉澤氏病(Glasser’sdisease)的病原菌，屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種多形態(tài)、非溶血性、不運(yùn)動(dòng)、NAD依賴型、革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。對營養(yǎng)要求比較苛刻，培養(yǎng)時(shí)必須供給含有V因子（NAD）或（NADP)的新鮮血液才能生長。此菌有多種血清型，其中強(qiáng)毒力的有1、5、10、12、13、14型，?？芍滤绖?dòng)物；中等毒力的有2、4、8、15型，多表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎，不致死；低毒力的有3、6、7、9、11型，常無臨床表現(xiàn)和病變。在中國，4型和5型是主要分離
2、株，而澳大利亞和丹麥的主要血清型為5型和13型。在研究2、4、5、12、13和14型間的交叉保護(hù)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了血清12型制備的單菌和血清2、12型制備的二價(jià)苗外，其他型都能對同源菌株產(chǎn)生保護(hù)；用血清4型制備的菌苗，可以保護(hù)血清5型的攻擊；用血清4、5型制備的二價(jià)菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻擊（仔豬病變的嚴(yán)重性和病死率明顯降低）。三價(jià)滅活疫苗主要用于預(yù)防豬副嗜血桿菌病。該苗針對性強(qiáng)，安全可靠，能有效降低發(fā)病率和死亡率。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的流程。2掌握副豬嗜血桿菌油乳劑滅活苗制作的操
3、作技術(shù)。二、乳化的原理乳化劑能降低分散物的表面張力，在微滴（粒）表面形成薄膜或雙片層，以阻止微滴（粒）的相互凝結(jié)。三、材料，試劑，培養(yǎng)基（1）器材：不銹鋼鍋（或瓷鍋）、電爐、乳化器、量筒、玻璃棒、離心機(jī)、吸管等。（2）試劑：、甲醛（滅活劑）、白油（抗原油相）、Span-80（油相乳化劑）、Tween-80（抗原水相乳化劑）、硬脂酸鋁（穩(wěn)定劑）、4、5、13型分離菌株（抗原）。（3）培養(yǎng)基的制備：1、配制0.2%的V因子準(zhǔn)確稱0.2g的NAD（輔酶I）加入100mlddH2O，用0.22um的細(xì)菌過濾器過濾除菌，4
4、°C保存?zhèn)溆谩?、制備TSA培養(yǎng)基稱16gTSA加入348ml雙蒸水，121°C高壓滅菌20min，當(dāng)溫度到50°C左右時(shí)（放入50°C水浴鍋）加入0.2%的V因子，使V因子濃度達(dá)100ug/ml，然后加入32ml的滅活新生牛血清100ml----4gTSA-----5mlV因子-------8ml血清3、TSB培養(yǎng)基稱3gTSB于87ml雙蒸水中溶解。121°C高壓滅菌15min，冷卻至50°C左右，加入已配制的0.2%的V因子5ml，再加入滅活的新生小牛血清8ml，使血清濃度達(dá)0.8%100ml-------
5、3gTSB----5mlV因子----8ml血清四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（1）菌株菌液制備及培養(yǎng)繁殖將副豬嗜血桿菌三株菌種按分別劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基平板上，37°C恒溫培養(yǎng)18-24h，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16h后，再將此菌液按l%的比例加入新配制的TSB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h后，按平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。培養(yǎng)24h后，收集菌液，用分光光度計(jì)法測定細(xì)菌總菌含量。經(jīng)檢驗(yàn)合格者作為制苗抗原。（2）制苗抗原的濃縮和細(xì)菌的滅活將純檢合格的制苗抗原培養(yǎng)物以超濾器濃縮，作為制苗用
6、濃縮抗原。然后按TSB液體培養(yǎng)基總體積加入終濃度為0.2%的甲醛（先10倍稀釋），充分搖勻后，37°C溫箱中滅活14h或分別在4、8、12、16、20h和24h取滅活菌液于TSA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，置普通恒溫箱中37℃培養(yǎng)48h，觀察細(xì)菌滅活效果。37°C滅活14h可達(dá)到較好的效果。（3）制苗用水相的制備 根據(jù)培養(yǎng)24h后的分光光度計(jì)法或麥?zhǔn)媳葷峁軠y定的總菌數(shù)結(jié)果，參照培養(yǎng)12-16h的平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果。取滅活的三種血清型按照一定的比例（等量）混合抗原液96份，然后過濾,除去沉渣及雜物,加入4份即終濃度為4
7、%滅菌的Tween-80(96∶4)充分混勻,邊加邊攪拌，使其充分融化（可加熱助溶，溫度低于37℃）,作為制苗用水相，水相要搖勻，讓吐溫-80充分溶解。（4）制苗用油相的制備 取10號白油93份（先加一部分，后補(bǔ)足）置于不銹鋼鍋中緩慢加熱后，加入硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到透明為止，再緩慢加入6份Span-80(司本-80)，充分混勻，121℃高壓蒸汽滅菌3Omin，冷卻至室溫備用。或者按比例將工業(yè)白油94份置于不銹鋼鍋（或瓷鍋）中加熱后，緩慢加入6份Span-80，混合后按總量加入2%硬脂酸鋁，溶化后，繼續(xù)升
8、溫至160℃，維持10min，待冷卻后即可制苗。切勿用少量的白油與硬脂酸鋁混合后邊煮邊攪拌，那樣很容易燒焦冒煙。（5）疫苗的制備（乳化工藝）按油相與水相2：1（v/v）混合乳化。即1份水相配2份油相在高速攪拌器中攪拌。先將處理好的油相2份置于高速攪拌器中，低速攪動(dòng)油相，同時(shí)緩慢加入水相l(xiāng)份(油∶水=2∶1)，乳化時(shí)膠體磨轉(zhuǎn)速由慢變快，最后以8，000一10，OO0r/ml
