資源描述：
《Western-blot基本操作步驟.docx》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、Westernblot基本操作步驟一、細胞蛋白的提取棄去培養(yǎng)基，加入預冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培養(yǎng)皿300-400μl，），于冰上裂解約5分鐘，裂解總液12000rpm離心10min。取上清，用BCA法測定蛋白濃度。用于westernblot的蛋白樣品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液補齊到所需上樣體積。離心，使蛋白沉底。將EP管于沸水中煮5min，變性，之后再離心后準備上樣。二、BCA法測蛋白濃度操作步驟將蛋白
2、標準配制溶液溶解蛋白標準（BSA），配制成5mg/ml的蛋白標準溶液，10μl分裝，-20℃冷凍保存。完全溶解蛋白標準品，取10μl用PBS稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml。據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內穩(wěn)定。將標準品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的標準品孔中，加稀釋標準品的溶液補足到20μl。加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中（可以通過預實驗摸索稀釋倍數(shù)），加PBS到20μl。各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分鐘。測定580nm條件下吸光度。根據(jù)標
3、準曲線計算出蛋白濃度。三、Westernblot基本操作步驟1、溶液配制：①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L；③TBST緩沖液1MTris·HCl（pH7.6）：60.5gTris-base，加入約30ml濃鹽酸，調PH至7.6，加MiliQ水至500ml。TBS緩沖液（10×）：1MTris·HCl100ml+80gNaCl加MiliQ水1LTBST緩沖液（1×）：TBS緩沖
4、液（10×）100ml+0.5mlTween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。④封閉液：5%BSA（5g/100ml，稱取1gBSA至20mlTBST，充分混勻溶解）2、樣品準備與加樣①用4×SDSloadingbuffer,10×reducing與蛋白質樣品混合，并將此EP管放在水浴鍋中沸水煮5min，使蛋白質變性。②將預制膠固定到電泳裝置中，并在裝置中加滿RunnigBuffer(1×)，內槽加入0.5mL抗氧化劑，小心拔下梳子；③向上樣孔中加入一定體積的蛋白樣品（總蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μlmarker（按照實驗要求設定marker量），向
5、空白孔中加入一定體積的加樣緩沖液(loadingbuffer)。注意采用相同（或相近）的上樣體積，以保證蛋白的各帶寬度相同。防止體積較大的上樣孔中的蛋白質將向相鄰的泳道擴散。3、電泳將電泳裝置與電源連接。調節(jié)電壓為100-200V，電泳50min，直至溴酚蘭接近分離膠的底部，然后關閉電源并撤去連接的導線。拆除電泳裝置：先倒掉電泳緩沖液，連同槽一起將凝膠夾層取出，小心的撬起凝膠外層塑料板，使凝膠暴露出來，切去濃縮膠以及無蛋白樣品的凝膠部分（將膠留在短的一面塑料板上）。4、轉膜（濕轉）①將轉膜液（1×TransferBuffer）放于大飯盒內，泡4片海綿，剪4片濾紙、1片PVDF膜，PVDF膜于
6、甲醇中活化30s，取出置于轉膜液中；②按照2層海綿+2層濾紙+膠+膜+2層濾紙+5層海綿（填滿）的順序組裝轉膜裝置，注意組裝此裝置時一定要保證濾紙、膜、凝膠精確對齊并不留氣泡；③將組裝好的裝置放入電轉槽，合上蓋子，電轉槽置于冰浴，接通電源，調節(jié)電壓為15V，時間為16~18h（或恒流300mA,3h）。顯示紅燈亮后，按下Start后，開始轉膜。轉膜方向為蛋白從負極（黑色）轉向正極（紅色）。5、免疫印跡反應及化學發(fā)光檢測轉膜完畢后，根據(jù)目的蛋白分子量將膜剪成不同的條帶，用封閉液（5%BSA）室溫封閉2h。棄封閉液，加入用新的封閉液稀釋的一抗（可回收），室溫2h或4℃過夜。用TBST清洗3次，1
7、0min/次。二抗（可回收）室溫孵育1小時，室溫1xTBST洗滌3次，每次約10min。此步開始避光操作：將膜浸入化學發(fā)光底物工作液（A液：B液=1:1，終體積0.5-1ml即可）中，顯色2分鐘，放入BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中顯影。內參分子量：β-actin：42kDaGAPDH：36kDaTubulin:51kDa
