豬細(xì)小病毒病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

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1、畜牧與飼料科學(xué)AnimalHusbandryandFeedScience2010，3l(8)：161—162豬細(xì)小病毒病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)孫運(yùn)華(安徽省碭山縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，安徽碭山235300)摘要：豬細(xì)小病毒可引起豬的繁殖障礙性疾病，其特征為感染母豬，特別是初產(chǎn)母豬，產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流產(chǎn)及病弱仔豬。給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失巨大。主要對(duì)豬細(xì)小病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)行了介紹，以期為有效防控該病提供參考。關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒：實(shí)驗(yàn)室診斷中圖分類號(hào)：$858．285．3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章順序編號(hào)：1672—5190(2010)08-0161-021病料的采集和處理

2、毒的核心直徑為14～17nm。取初產(chǎn)母豬的流產(chǎn)胎兒、死胎、木乃伊胎及弱仔的腦、3．2間接Dot—ELISA間接Dot—ELLISA見(jiàn)血清學(xué)診斷腎、睪丸、肺、肝、腸系膜淋巴結(jié)或母豬的胎盤和陰道分泌物4．2。等，病料按(1：5)～(1：10)比例，加入含青霉素(1000IU／4血清學(xué)診斷mL)、鏈霉素(1000mL)、卡那霉素(1000IU／mL)的4．1間接免疫熒光法0．5％水解乳蛋白溶液，研磨制成無(wú)菌乳劑．冰箱過(guò)夜，30004．1．1材料準(zhǔn)備：①病毒抗原的制備：將PPV細(xì)胞培養(yǎng)液凍r／min離心10min，取上清液置一20℃保存?zhèn)溆?。?次，3000r／min離心3

3、0rain，取出細(xì)胞碎片，凍干法濃縮2病原的分離l2倍。血凝效價(jià)(HA)達(dá)1：1024，加雙抗(400txg／mL)，細(xì)胞培養(yǎng)：按細(xì)胞培養(yǎng)液的1：10比例，將上述病料乳劑置一20℃保存?zhèn)溆?。@PPV高免血清的制備：選用4月齡的的上清液接種于幼齡生長(zhǎng)旺盛而又未形成單層的原代仔豬健康仔豬，經(jīng)血檢，HI效價(jià)在1：20以下，首免用PPV濃縮病腎細(xì)胞，37℃吸附90min，中途輕搖數(shù)次，傾去接種液，加入毒，口服和滴鼻劑量分別為20mL和10mL；第2次免疫，肌維持液(為0．05％水解乳蛋白M199溶液，內(nèi)含2％犢牛血肉注射20mLPPV濃縮病毒；三免在后海穴注射5mLPPV清

4、，l％的1mmol／L丙酮酸鈉，青霉素100IU／mL，鏈霉素100濃縮病毒；四免在耳靜脈注射10mLPPV濃縮病毒。在末次m咖L，制霉菌素50IU／mL)，37℃靜止培養(yǎng)，每天觀察1次，免疫后1周采血．HI效價(jià)達(dá)1：1024，由頸靜脈采血，分離血連續(xù)培養(yǎng)7～10d，盲傳3代，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，觀察細(xì)胞有無(wú)清，過(guò)濾除菌、分裝，一20℃條件下保存?zhèn)溆谩＂弁每关iIgG細(xì)胞病變(CPE)及血凝素出現(xiàn)，如病料有豬細(xì)小病毒(PPV)熒光抗體(商品化試劑)。④陽(yáng)性對(duì)照：已知的PPV感染細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)16～36h時(shí)，可觀察到細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體，5～培養(yǎng)蓋玻片，加PPV高免血清(1：

5、40)感作后，經(jīng)洗滌，再加10d可見(jiàn)特征性CPE．開(kāi)始細(xì)胞中出現(xiàn)彌漫性顆粒，繼而細(xì)兔抗豬IgG染色及觀察。⑤陰性對(duì)照：無(wú)PPV感染細(xì)胞培養(yǎng)胞變圓、叢集、固縮，崩解的細(xì)胞外形不整，最后脫離瓶壁。出蓋玻片，加PPV高免血清(1：40)感作后，經(jīng)洗滌，再加兔抗現(xiàn)CPE的培養(yǎng)液再用已知的特異性血清進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。豬IgG染色、觀察。⑥標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照片：空白細(xì)胞培養(yǎng)3病毒鑒定蓋玻片。封裱后鏡檢。⑦熒光抗體對(duì)照：空白細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻3．1電鏡檢查將被檢驗(yàn)品用磷鎢酸染色液進(jìn)行負(fù)性染片，再加兔抗豬IgG染色、觀察。⑧病料的采集及冰凍切片色l～2min后，在電鏡下進(jìn)行檢查，可見(jiàn)到病毒直

6、徑為18～的制備：采取死胎和胎兒的肝、肺、腎組織制成冰凍切片，丙20llm，呈球形、橢圓形或六角形病毒粒子，病毒無(wú)囊膜，病酮固定，供觀察用。4．1．2操作程序：將細(xì)胞蓋玻片或4m的組織冰凍切片，收稿日期：2010—07—27用冷丙酮固定10rain，每個(gè)樣品取2張片，分別滴加PPV高作者簡(jiǎn)介：孫運(yùn)華(1964一)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。免血清(1：40)，置37℃恒濕、恒溫箱中，感作30min后，緩沖牛子50g，炒葶藶子50g，炙枇杷葉50g，用法：水煎，加雞治措施，使疫情迅速地得到控制。蛋清為引，10頭仔豬為1劑，一次灌服，2次，d，連用3

7、d。通③豬群發(fā)生該病后，必須早診斷、早治療。及時(shí)采取綜過(guò)采取以上綜合性防治措施，只有癥狀較嚴(yán)重的1O頭仔豬合性的防治措施．才能使疫情很快得到控制。用藥時(shí)。必須死亡，其余132頭仔豬全部恢復(fù)健康。考慮到混合感染，要用2種病的特效藥物對(duì)混合感染進(jìn)行7體會(huì)控制。否則，會(huì)使疫情加重，死亡率增高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損①根據(jù)對(duì)發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化以及實(shí)驗(yàn)室檢失。驗(yàn)與防治效果的綜合分析，確診該豬群發(fā)生的疫病為豬瘟④該養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生豬瘟與豬肺疫混合感染，主要是由于與豬肺疫混合感染。從周圍鄉(xiāng)(鎮(zhèn))購(gòu)進(jìn)仔豬，飼養(yǎng)環(huán)境的突然改變，再加上該②豬瘟的臨床癥狀及病理變化不夠典型，只憑眼觀判