嗅鞘細胞分離培養(yǎng).doc

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1、嗅鞘細胞分離培養(yǎng)嗅鞘細胞分離有傳統(tǒng)分離法:1.顯微解剖分離嗅球；2.嗅球置于少量ACSF（人工腦脊液）屮（4°C冰浴），在解剖顯微鏡下，將位于嗅球最外層的嗅神經(jīng)層、嗅神經(jīng)及包被的腦膜輕輕剝下，用ACSF洗2次；（用ACSF浸泡組織塊，常溫放置（室溫低于26°C吋采用）或4°C放置（室溫高于26°C吋采用）不超過2h）3.組織塊用ACSF洗滌兩遍：向裝有組織塊的EP管加入lml含2*P/S的ACSF,小心移除ACSF,-再次加入1ml含2*P/S的ACSF,小心徹底移除ACSF；4.加入組織塊5倍體積0.125%胰酶（用基礎(chǔ)DMEM稀釋）

2、，用小剪刀把組織塊盡量剪碎，用封口膜封口后，置于37°C水浴鍋屮，孵育20min,每隔5min彈勻一次；5?孵育結(jié)朿后，立即加入1ML完全培養(yǎng)基（DMEM,10%FBS）,立即混勻，1000g,室溫,離心1Omin,小心移除上清；立即加入0.5ML完全培養(yǎng)基（DMEM,IO%FBS）重懸細胞及組織，吹打12下，把細胞及組織懸液放置于24孔板屮，補加培養(yǎng)基至總體積為1.5ml。分層消化法:1.顯微解剖分離嗅球；（用ACSF浸泡組織塊，常溫放置（室溫低于26°C時采用）或4°C放置（室溫高于26°C吋采用）不超過2h）2.嗅球用ACSF洗滌

3、兩遍：向裝有嗅球的EP管加入lml含2*P/S的ACSF,小心移除ACSF,再次加入lml含2*P/S的ACSF,小心徹底移除ACSF；1.加入組織塊5倍體積0.125%胰稱（用基礎(chǔ)DMEM稀釋），置于37°C水浴鍋屮,孵育15min,每隔5min彈勻一次，移出含有細胞的酶液，立即加入1ML完全培養(yǎng)基（DMEM,10%FBS）,立即混勻，lOOOg,室溫,離心lOmin,小心移除上清；立即加入0.5ML完全培養(yǎng)基（DMEM,10%FBS）重懸細胞，吹打6下，把細胞懸液放置于24孔板屮，補加培養(yǎng)基至總體積為1.5mlo2.剩余的嗅球再用酶

4、消化，重復(fù)以上操作（第3步）6次，細胞懸液分別收集于6支小試管內(nèi)備用。直接擠壓法:1.顯微解剖分離嗅球；（用ACSF浸泡組織塊，常溫放置（室溫低于26°C時采用）或4°C放置（室溫高于26°C時采用）不超過2h）2.嗅球用ACSF洗滌兩遍：向裝有嗅球的EP管加入1ml含2*P/S的ACSF,小心移除ACSF,再次加入lml含2*P/S的ACSF,小心徹底移除ACSF；3.嗅球置于2倍體積ACSF屮，用眼科銀子直接將嗅球撕爛、擠壓，將剩余的片狀組織塊轉(zhuǎn)移至另一試管內(nèi)（用錫子移取貨離心除上清），用ACSF洗2次（用錫子移取貨離心除上清）；3

5、.加入組織塊5倍體積0.125%胰酶（用基礎(chǔ)DMEM稀釋），用小剪刀把組織塊盡量剪碎，用封口膜封口后，置于37°C水浴鍋屮，孵育20min,每隔5min彈勻一次；4?孵育結(jié)束后，立即加入1ML完全培養(yǎng)基（DMEM,10%FBS）,立即混勻，1000g,室溫,離心lOmin,小心移除上清;立即加入0.5ML完全培養(yǎng)基（DMEM,10%FBS）重懸細胞及組織，吹打12下，把細胞及組織懸液放置于24孔板屮，補加培養(yǎng)基至總體積為l.5mlo