利用ssr分子標記快速鑒定雜交水稻種子純度技術體系的優(yōu)化

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1、維普資訊http://www.cqvip.com·●·60·雜交水稻(HYBRIDRICE)，2008，23(1)：60—63利用SSR分子標記快速鑒定雜交水稻種子純度技術體系的優(yōu)化劉之熙，陳祖武，朱克永，李召華，詹慶才’(1．中南大學研究生院隆平分院，湖南長沙410125；2．湖南省水稻研究所生物技術室，湖南長沙410125)摘要：針對目前SSR分子標記技術快速鑒定雜交水稻種子純度方法商業(yè)化應用的限制因素，從DNA提取、PCR反應體系和程序及凝膠電泳等方面進行了技術體系的優(yōu)化。原方法經(jīng)優(yōu)化后，DNA提取時間從每次5h以上減少

2、到2．5min，PCR反應過程從200min縮短至65min，改聚丙烯酰胺凝膠電泳為瓊脂糖凝膠電泳，電泳時間由3．0—3．5h縮短為1h，且通過減少dNTP、Taq酶的用量，對瓊脂糖凝膠反復利用，大大降低了成本，減少了廢棄物的污染，從而建立了準確、簡單、快速、成本低廉的快速鑒定雜交稻種子純度的技術體系。關鍵詞：雜交水稻；SSR分子標記；純度鑒定；技術體系優(yōu)化中圈分類號：S511；Q75文獻標識碼：A文章編號：1005—3956(2008)叭一0060—04中國是世界上第1個在生產(chǎn)上成功利用水稻雜業(yè)化的因素進行了技術體系的優(yōu)化。

3、種優(yōu)勢的國家。隨著全國雜交水稻種植面積逐年增1SSR分子標記鑒定技術體系的優(yōu)化大，雜交水稻種子年使用量已達到2．5億kg左右¨J，而雜交水稻種子的質(zhì)量糾紛越來越普遍，因1．1DNA提取方法的簡化此種子的質(zhì)量(主要是真實性和純度)檢查和監(jiān)督針對傳統(tǒng)提取方法，如CTAB法、STS法耗費時尤顯重要。間長，提取成本高等問題，提出了簡單的DNA提取SSR(SimpleSequenceRepeats)分子標記具有方法：剪取0．5cm長的水稻幼苗(幼葉或幼莖)，放數(shù)量豐富、多態(tài)性高、實驗操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、入96孔PCR板的孔中，每孔加

4、入40L0．25molfL引物序列易交流等優(yōu)點，在遺傳連鎖圖譜的構(gòu)的NaOH，在沸水中煮30s，然后加入40L0．25建、種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性的研究～’、基因的molfL的HC1和20I．zL0．5molfL的Tris(pH8．0，定位與分離_6J、品種純度鑒定”等方面得到了含有體積分數(shù)為0．25％的IGEPAL—CA630)的混日益廣泛的應用。國內(nèi)許多科研單位開展了利用合液，在沸水中煮沸2min，用1I．zL進行PCR擴增，SSR技術進行雜交玉米?、雜交油菜¨n、雜交或4cc保存。水稻¨種子純度鑒定的研究，但成本都比較高，1

5、．2PCR反應體系和程序的優(yōu)化在生產(chǎn)上推廣應用比較困難。SSR分子標記應用于為了盡可能降低成本，縮短反應時間，以雜交稻雜交水稻種子純度鑒定產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，有以下制約因組合兩優(yōu)培九及其母本培矮64S、父本9311為材素：DNA提取操作步驟較多；PCR程序時問長；聚料，RM234為引物，對PCR反應體系和PCR反應程丙烯酰胺凝膠電泳制膠過程復雜，電泳時間長，處理序進行了多因素多水平正交試驗篩選。樣品量有限；成本高(Taq酶、dNTP用量大，DNA提1．2．1試驗因素與水平設計取成本高)。1)DNA擴增反應體積：5，10，15，20I．

6、zL。2)反一方面DNA指紋鑒定技術日趨成熟，在分子水應體系中dNTP總濃度：0．05，0．10，0．15，0．20平上鑒定品種純度成為必然的發(fā)展趨勢；另一方面mmoL／L。3)反應體系中TaqGoldDNA聚合酶用大規(guī)模地應用SSR標記對200株以上的群體進行純度鑒定時，怎樣與國家標準接軌、能否實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化收稿日期：2007—12—10等問題擺在了分子鑒定工作者的面前：必須盡一切基金項目：科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2007GB2D200225)可能降低成本，最好能接近海南種植鑒定的成本。作者簡介：劉之熙(1981一)，女

7、，山西長治人，在讀碩士生。電話本文針對現(xiàn)有的SSR標記技術在鑒定雜交水稻種0731—4691351；E—mail：liuzhlxi0505@163．COB。子純度時難以適應商業(yè)化開發(fā)的問題，對限制其商通訊作者：電話：0731—4691351；E—mail：zhanqc@hotmail．eonl。維普資訊http://www.cqvip.com劉之熙等：利用SSR分子標記快速鑒定雜交水稻種子純度技術體系的優(yōu)化·6l·量：0．1，0．2，0．5，1．5單位。4)PCR反應程序：a)1．3電泳方法的選擇94cC預變性4min；94c

8、c1min，55cc1min，72(℃2針對聚丙烯酰胺凝膠制膠復雜、電泳時間長、污rain，35個循環(huán)；72℃5rain；b)94c【=預變性4min；染嚴重等弊端，選擇瓊脂糖凝膠進行電泳分離：在擴94c【=30S，55℃30S，72c【=lrain．35個循環(huán)；72cE5增