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1、第第第十十十章章章一、高效液相色譜儀高效液相色譜分析法高效液相色譜分析法高效液相色譜分析法HPLChighperformanceliquid二、高效液相色譜法的特點(diǎn)chromatographfeatureofHPLC三、流程及主要部件第一節(jié)第一節(jié)第一節(jié)generalprocessandmain高效液相色譜的高效液相色譜的高效液相色譜的assemblyofHPLC特點(diǎn)與儀器特點(diǎn)與儀器特點(diǎn)與儀器featureandinstrumentofHPLC2005-12-7概述——HPLC高效液相色譜是一種以液體作為流動(dòng)相的色譜技術(shù)。在經(jīng)典柱
2、色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜法的理論，在技術(shù)上使用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快，分離效率高和操作自動(dòng)化。其原理是由流動(dòng)相液體將被分離混合物帶入色譜柱中，根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。由于高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了檢出極限，縮短了分析時(shí)間。常規(guī)分析一個(gè)樣品僅需數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘，較經(jīng)典柱色譜快100一1000倍2005-12-7高效液相色譜法與氣相色譜法比較：（1）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低
3、的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。高效液相色譜法分離對(duì)象是高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，占有機(jī)物總數(shù)近80％。(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒(méi)有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。2005-12-7(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。高效
4、液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點(diǎn)，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。2005-12-7一、液相色譜儀器一、液相色譜儀器一、液相色譜儀器highperformanceliquidchromatograph2005-12-7液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（222）））2005-12-7液相色
5、譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（333）））2005-12-7液相色譜儀（液相色譜儀（液相色譜儀（444）））2005-12-7二、二、二、高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn)高效液相色譜法的特點(diǎn)featureofHPLC特點(diǎn)：高壓、高效、高速、高靈敏度、高度自動(dòng)化是對(duì)高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2005-12-7⑴高壓經(jīng)典液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大。在現(xiàn)代液相色譜法中，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高壓力可達(dá)4.9107Pa），所以高壓是高效液相色譜法的特點(diǎn)之一。⑵高速由于
6、使用高壓泵輸送流動(dòng)相、采用梯度洗脫裝置、用檢測(cè)器在柱或直接檢測(cè)洗出液成分等原因，HPLC完成分離分析的時(shí)間只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典液相色譜法要快得多。⑶高效由于使用了細(xì)粒度的高效填充劑和均勻的填充技術(shù)，高效液相色譜法分離效率極高，柱效一般可達(dá)每米104理論塔板數(shù)。近幾年來(lái)出現(xiàn)的微型填充柱（內(nèi)徑1mm）和毛細(xì)管色譜柱（內(nèi)徑0.05mm），柱效超過(guò)了每米105理論塔板數(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)極為有效的分離。2005-12-7⑷高靈敏度采用紫外、熒光、電化學(xué)等高靈敏度的檢測(cè)器，使HPLC的靈敏度可以與氣相色譜法媲美。最小檢測(cè)量UV可達(dá)10-9
7、g；熒光可達(dá)10-11g；光電二極管陣列檢測(cè)器，除了具有與UV基本相同的靈敏度外還可提供三維色譜圖、多波長(zhǎng)色譜圖；激光誘導(dǎo)—熒光檢測(cè)器，靈敏度可達(dá)到10-23摩爾，也就是說(shuō)可檢測(cè)單個(gè)分子數(shù)量級(jí)。除此之外，所需試樣少，微升數(shù)量的就足以滿足進(jìn)行全分析。⑸高度自動(dòng)化現(xiàn)代先進(jìn)的高效液相色譜儀配有計(jì)算機(jī)，不僅能夠自動(dòng)處理數(shù)據(jù)、繪圖、和打印分析結(jié)果，而且能夠?qū)x器的全部操作包括流動(dòng)相的選擇、流速、柱溫、檢測(cè)器波長(zhǎng)選擇、進(jìn)樣、梯度洗脫方式等進(jìn)行程序控制，成為全自動(dòng)化的儀器。2005-12-7三、流程及主要部件三、流程及主要部件三、流程及主要部
8、件processandmainassemblyofHPLC1.流程2005-12-72005-12-72.主要部件（1）輸液系統(tǒng)由流動(dòng)相貯液器、高壓泵、梯度洗脫裝置、壓力表組成，其作用是保證流動(dòng)相能正常工作。高壓輸液泵——是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓的形式連續(xù)
