資源描述：
《噬菌體效價(jià)的測(cè)定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)九 噬菌體效價(jià)的測(cè)定目的要求1、掌握噬菌體效價(jià)測(cè)定的原理及方法2、觀察噬菌斑的形態(tài)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)物品的準(zhǔn)備本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作（2人/組）1、配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液（pH7.4-7.6）；（已準(zhǔn)備好）。2、測(cè)定效價(jià)時(shí)稀釋用9ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液——2支/組，分裝于18×180mm試管；3、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（2%的瓊脂）——底層用，150ml/組，裝于250ml三角瓶，（用于制備9個(gè)無菌平板，倒薄一點(diǎn)）4、上層用5ml牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基（0.8%的瓊脂），融化后分裝于15×150
2、mm試管中加塞包扎滅菌，10支/組；（上周已準(zhǔn)備好）。5、1ml無菌吸管4支/組。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二噬菌體知識(shí)介紹一、幾個(gè)重要概念1、噬菌體：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，分布極廣，個(gè)體很小，在光學(xué)顯微鏡下看不見，需用電鏡觀察。不同的噬菌體在電鏡下有三種形態(tài)：蝌蚪形、微球形和絲形。大多數(shù)噬菌體呈蝌蚪形，由頭部和尾部?jī)刹糠纸M成。2、噬菌斑：在混濁的細(xì)菌菌面（菌苔）上形成的透明區(qū)域，是由噬菌體不斷侵染宿主細(xì)胞裂解形成的，其形狀、大小不等。3、噬菌體效價(jià)：指1mL樣品中所含具有侵染活性的噬菌體（烈性噬菌
3、體）數(shù)量——噬菌斑形成單位（pfu，plaque-formingunit）。效價(jià)（titre，titer）這一名詞在不同的場(chǎng)合有其不同的含義（如抗生素等）。二、病毒粒子的構(gòu)造（模型）噬菌體的形態(tài)及分類科屬大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖大腸桿菌T4噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖 及電鏡照片頭部六角形基板領(lǐng)環(huán)螺旋形尾鞘核心或管（中空）尾刺或刺突尾絲噬菌斑示意照片宿主細(xì)菌菌苔噬菌斑大腸桿菌T噬菌斑的表型形態(tài)三、噬菌體的分類——根據(jù)噬菌體與宿主菌的相互關(guān)系烈性噬菌體（virulentphage）能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代
4、噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。溫和噬菌體（temperatephage）噬菌體基因與宿主染色體整合，不產(chǎn)生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細(xì)菌DNA復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而傳代，存在游離態(tài)、整合態(tài)、營養(yǎng)態(tài)三種形式。針對(duì)溫和噬菌體來說：前（原）噬菌體、溶源菌四、噬菌體繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟裝配5、裂解釋放T4噬菌體吸附和DNA的注入T偶數(shù)噬菌體感染大腸桿菌 的掃描電鏡照片T4噬菌體的生活周期T4噬菌體的裝配五、噬菌體的應(yīng)用1、細(xì)菌的鑒定與分型噬菌體與宿主菌的關(guān)系具有高度特異性，即一
5、種噬菌體只能裂解一種和它相應(yīng)的細(xì)菌，故可用于未知細(xì)菌的鑒定和分型。2、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)研究的重要工具噬菌體基因數(shù)量少，結(jié)構(gòu)比細(xì)菌和高等細(xì)胞簡(jiǎn)單得多，且易獲得大量的突變體——構(gòu)建基因文庫（λ噬菌體）；基因工程載體；噬菌體展示技術(shù)。3、細(xì)菌感染的診斷與治療利用其專一性，可以診斷和治療一些相關(guān)細(xì)菌感染性疾病（用于治療時(shí)，其分泌的細(xì)菌素也可以應(yīng)用，臨床外傷治療已有應(yīng)用）但專一性也限制了噬菌體在臨床上的廣泛應(yīng)用（人們最需要的是廣譜性）。六、噬菌體的危害在工業(yè)上會(huì)造成所培養(yǎng)菌體的大量裂解，使生產(chǎn)難以完成。表現(xiàn)形式：①
6、發(fā)酵周期明顯延長(zhǎng)；②碳源消耗緩慢；③發(fā)酵液變清，鏡檢時(shí)，有大量異常菌體出現(xiàn)；④發(fā)酵產(chǎn)物的形成緩慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板檢查時(shí)，出現(xiàn)大量噬菌斑；⑥用電子顯微鏡觀察時(shí)，可見到有無數(shù)噬菌體粒子存在。輕則延長(zhǎng)發(fā)酵周期、影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，重則引起倒罐甚至使工廠被迫停產(chǎn)。七、以防為主的措施：1、決不使用可疑菌種；2、嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生；3、決不排放或隨便丟棄活菌液；4、注意通氣質(zhì)量空氣過濾器要保證質(zhì)量并經(jīng)常進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，空氣壓縮機(jī)的取風(fēng)口應(yīng)設(shè)在30～40米高空；5、加強(qiáng)管道及發(fā)酵罐的滅菌；6、不斷篩選抗性菌種
7、，并經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；7、嚴(yán)格執(zhí)行會(huì)客制度。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三噬菌體效價(jià)的測(cè)定一、噬菌體效價(jià)測(cè)定的方法 （梯度稀釋）斑點(diǎn)試驗(yàn)法液體稀釋試管法——以不長(zhǎng)菌判斷（澄清）雙層平板法——最常用，優(yōu)點(diǎn)較多單層平板法載玻片法——快速其它病毒的效價(jià)（計(jì)數(shù)）測(cè)定——空斑計(jì)數(shù)、電子顯微鏡直接計(jì)數(shù)、免疫學(xué)間接測(cè)定（凝集、ELISA——酶標(biāo)儀）噬菌體效價(jià)測(cè)定的方法二、雙層平板法單層與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較雙層平板法的優(yōu)點(diǎn)：①加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補(bǔ)；②所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此
8、不僅每一噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象；③因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計(jì)數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)原理一個(gè)噬菌體→侵染細(xì)胞→引起裂解→擴(kuò)散重復(fù)裂解→形成一個(gè)噬菌斑（瓊脂凝膠中）宿主細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于噬菌體數(shù)？噬菌體效價(jià)（pfu/ml）=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)四、實(shí)驗(yàn)步驟1、制備底層平板將已滅菌融化的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板9個(gè)（倒薄一些），凝固。2、加入大腸桿菌敏感菌在每個(gè)
