資源描述：
《采取羊駝外周血.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、試劑及器材：真空采血管，酒精，剪刀，碘酒，棉簽，抗凝劑肝素鈉，一次性針頭，冰盒，一次性乳膠手套，標(biāo)簽紙，試管。采用真空采血管收集約15mL健康羊駝(Lamapacos)外周血,用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心收集單核細(xì)胞。采血:采血前,先在羊駝?lì)i部約1/3處找準(zhǔn)靜脈后剪毛,用碘酒、酒精進(jìn)行局部消毒（先用25%的碘酒消毒，用棉簽畫圈消毒，待干后，再用75%酒精消毒兩遍）。然后用容積5ml的一次性真空采血管(內(nèi)含抗凝劑肝素鈉,并附有一次性針頭)在羊駝的頸靜脈采血5.Oml,（采血后，用干棉簽按壓針頭）然后迅速拔出針頭,并輕
2、輕轉(zhuǎn)動(dòng)真空采血管,使血液與抗凝劑充分混和,立即置于裝有冰塊的冰壺內(nèi),并在20h內(nèi)將冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室。（采血后，取下針頭，將血液緩慢沿試管壁注入干試管中，避免震蕩以防止血液凝固，加抗凝劑）然后在無菌條件下在每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)滴入10一13滴抗凝血,輕輕搖動(dòng),使血與培養(yǎng)液充分混和。羊駝外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和總RNA的提取采取羊駝外周靜脈血,以肝素抗凝,,采用密度梯度離心方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞,按每10細(xì)胞溶于1mlTRIzol中,參照TRIzol試劑使用說明抽提總RNA。提取后的總RNA用DEPC處理過的去離子水
3、溶解,測(cè)定濃度,并于-80保存?zhèn)溆?。紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA的完整性淋巴細(xì)胞的分離將采集的羊駝外周血與等體積磷酸緩沖液PBS(pH7．4)混合，淋巴細(xì)胞分離液(1．077)離心分離(20℃，800g，15min)，收集淋巴細(xì)胞。全血中白細(xì)胞的分離抗凝血液樣本中加入等體積的PBS緩沖液,混勻;1在一體積足夠大的離心管,加入淋巴細(xì)胞分離液;2取與淋巴細(xì)胞分離液等體積的樣本液,將其小心注入淋巴細(xì)胞分離液液面上;320℃,800g離心15min;4小心吸取中間層懸浮的白細(xì)胞至一新的離心管中,加入lxPBS
4、至smL;5取10林L稀釋一倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),其余的20℃,8009離心15min:6棄上清,在沉淀(白細(xì)胞)中加入裂解液(RNAiso),體積比l:20;7用移液器反復(fù)吹吸至裂解液中無明顯沉淀;8在15一300C,靜置5min?？俁NA提取1加入1/5體積氯仿,用力振蕩至充分乳化(約15s),室溫靜置5min;212000g,4℃,15min:3小心取出離心管,取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管;4加入等體積異丙醇,顛倒混勻,15一30℃靜置10min;5120009,4℃,10min:6棄去上清;7緩慢沿管壁加入1mL
5、75%乙醇,上下顛倒;812000g,4℃,5min;9去乙醇;11取1uL總RNA在ND1000紫外分光光度計(jì)上分別測(cè)定230nm、260nm、280lun和320nm處的吸光度值;12通過計(jì)算OD26。、OD260/OD28。確定總RNA的數(shù)量與質(zhì)量;13取2uL總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。
