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1、第四章酶的分離純化及產(chǎn)品成型（1）酶的抽提（2）酶的分離純化：沉淀分離、離心分離、膜過濾、層析分離、電泳分離（3）酶液的濃縮、結(jié)晶、干燥、成型（4）酶純化過程的純度監(jiān)測本章知識點：一、生物下游加工技術(shù)下游加工過程包括目標(biāo)產(chǎn)物的提取、濃縮、純化及成品化等過程。生物產(chǎn)物從原料（培養(yǎng)液或細(xì)胞）生產(chǎn)到產(chǎn)品的后處理技術(shù)（分離純化技術(shù)）的發(fā)展，使低成本、高收率地純化目標(biāo)產(chǎn)物成為現(xiàn)實。大多數(shù)酶的回收純化過程成本約占70%；醫(yī)用酶的生產(chǎn)回收過程的成本高達(dá)85%；基因工程表達(dá)產(chǎn)物的回收純化過程成本一般占85-90%以上；青霉素回收過程成本約占50%；乙醇的回收過程成本僅占14%
2、。二、分離純化的一般流程原料液細(xì)胞分離（離心、過濾）細(xì)胞（胞內(nèi)產(chǎn)物）清液（胞外產(chǎn)物）細(xì)胞破碎碎片分離粗分離純化成品化線路2線路1人干擾素、是一種重要蛋白類生物藥品，具有抗癌和治療肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸鋅鹽析離子交換層析硫酸銨鹽析銅螯合層析疏水層析凝膠電泳staehelin等人：硫酸銨鹽析免疫親和層析陽離子交換層析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，總收率僅為16%僅三步，總收率達(dá)81.0%在實踐工作中選擇方法時:首先，應(yīng)對被純化的酶的理化性質(zhì)有—個比較全面的了解;其次，判斷采用的方法和條件
3、是否得當(dāng)，始終以測定酶活性為標(biāo)準(zhǔn)。再者，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采用相同的步驟和條件。最后，要嚴(yán)格控制操作條件。隨著酶的逐步純凈，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間的相互作用力隨之下降,酶更不穩(wěn)定，因此,更要防止酶變性。三、酶分離純化的基本原則（一）酶分離純化包括三個基本環(huán)節(jié)抽提純化精制（二）酶分離純化應(yīng)注意以下問題1、防止酶變性失活：溫度、pH、泡沫、重金屬等。2、選擇有效的純化方法。3、酶活性測定與總蛋白質(zhì)含量測定應(yīng)貫穿純化過程的始終。第一節(jié)從發(fā)酵液制取酶提取液（酶溶液的制備）一、發(fā)酵液的預(yù)處理目的：降低粘度，便于固液分離方法：（1）加熱：適用于耐熱的酶，
4、注意常要加適當(dāng)?shù)拿副Ｗo(hù)劑。（2）加凝聚劑或絮凝劑（3）調(diào)pH值二、固液分離方法：（1）離心分離；（2）過濾；（3）雙水相萃取三、細(xì)胞破碎機(jī)械破碎法物理破碎法化學(xué)破碎法：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機(jī)溶劑和Triton、Tween等表面活性劑酶促破碎法搗碎法：搗碎機(jī)研磨法：研缽、細(xì)菌磨、石磨、球磨等勻漿法：勻漿器溫度差破碎法：凍融交替法壓力差破碎法：高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法超聲波破碎法自溶法加酶處理G+菌：溶菌酶G-菌：溶菌酶、巰基乙醇等酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶霉菌：幾丁質(zhì)酶四、抽提（一）抽提方法指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充?/p>
5、溶解到溶劑中的過程，也稱為酶的提取。四稀：稀酸、稀堿、稀鹽、稀有機(jī)溶劑（二）抽提過程中的注意事項1、pH值：選擇的pH值不超出酶的酸堿穩(wěn)定范圍；最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點。2、溫度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有機(jī)溶劑提取時。3、抽提液體積（用量）抽提液的用量一般為含酶原料體積的2~5倍?？梢淮纬樘?，也可分幾次反復(fù)抽提。4、為提高酶的穩(wěn)定性，可以加入適量的保護(hù)劑。分離依據(jù)的性質(zhì)分離方法根據(jù)分大小、輕重離心分離、凝膠過濾、膜分離根據(jù)溶解度大小鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、共沉淀、選擇性沉淀、等電點沉淀根據(jù)電學(xué)性質(zhì)離子交換層析、電泳分離根據(jù)穩(wěn)定性差異選擇性熱變性法、
6、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法根據(jù)親和作用親和層析、親和電泳酶分離純化方法：現(xiàn)有的純化方法，都是以酶與雜蛋白在理化性質(zhì)、穩(wěn)定性上的差異以及酶的生物學(xué)特性為依據(jù)而建立起來的。第三節(jié)酶的沉淀分離鹽析沉淀法√、等電點沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法一、鹽析沉淀法1、原理：2、硫酸銨鹽析的優(yōu)點優(yōu)點：①在水中溶解度大，溶解的溫度系數(shù)??；②價廉，便宜；③可保護(hù)酶。缺點：溶解過程隨濃度增加的體積變化是非線性的變化。3、鹽析操作（1）硫酸銨的飽和度×100%（NH4）2SO4的飽和度（%）=實際濃度飽和濃度0.4S=40%（飽和度）（2）調(diào)整鹽濃度的方法加飽和（NH4）
7、2SO4溶液：VV0（S2-S1）1-S2=V0—原來溶液的體積V—所需加入飽和硫酸銨的體積S1—原來溶液的硫酸銨飽和度S2—所需達(dá)到的硫酸銨飽和度例：將2升0.2S的硫酸銨溶液提升至0.5S，需加飽和硫酸銨多少升？溶液體積增加多少倍？加固體（NH4）2SO4：WB（S2-S1）1－AS2=W—將1L飽和度為S1的溶液提高到S2所要添加的固體硫酸銨克數(shù)；A、B—與溫度有關(guān)的經(jīng)驗常數(shù)例：某酶制劑廠生產(chǎn)15噸蛋白酶發(fā)酵液，用硫酸銨進(jìn)行鹽析,要求硫酸銨的飽和度達(dá)到40%，計算需要加入固體硫酸銨多少kg?（25℃）經(jīng)驗常數(shù)0℃10℃20℃25℃30℃A0.2710.2
8、810.2900.2940.298B（
