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1、華北農(nóng)學(xué)報(bào)·2015，30(1)：35．41溶藻弧菌附著定植因子ACFA原核載體構(gòu)建、表達(dá)條件優(yōu)化及多克隆抗體制備劉祥(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001)摘要：為構(gòu)建水產(chǎn)致病菌溶藻弧菌附著定植因子ACFA原核表達(dá)載體，優(yōu)化ACFA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，制備ACFA蛋白小鼠多克隆抗體。通過分子克隆獲得ACFA蛋白的表達(dá)菌株，利用切膠純化獲得ACFA蛋白，免疫小鼠制備多克隆抗體，采用ELISA法檢測抗體滴度為1：3200倍，Western—Blotting法檢測抗血清特異性較好。通過正交試驗(yàn)，獲得AC
2、FA菌株的最佳表達(dá)條件為：誘導(dǎo)時(shí)菌液OD。。值0．5，加IPTG終濃度0．3mmol／L，誘導(dǎo)時(shí)間8h，誘導(dǎo)溫度32℃；最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度0，轉(zhuǎn)速230r／min，裝液量50mL。關(guān)鍵詞：溶藻弧菌；ACFA蛋白；正交試驗(yàn)；多克隆抗體中圖分類號：Q816文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000—7091(2015)O1—0035—07doi：10．7668／hbnxb．2015．01．007ConstructionProkaryoticVector，OptimizationExpressionConditionsan
3、dPolyclonaiAntibodyPreparationofVibrioalginolyticusAccessoryColonizationFactorACFALIUXiang(CollegeofBiologicalSciencesandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723001，China)Abstract：ToconstructprokaryoticexpressionvectorofaquaticpathogenicVibrioalgi
4、nolyticusaccessorycoloni-zationfactorA(ACFA)，optimizetheexpressionconditionofACFAandpreparethepolyclonalantibodiesofmouseanti—ACFA．TheACFAexpressionstrainwasobtainedbymolecularclone．ACFAwaspurifiedbythewayofthegelslices，immunizedmiceandpreparedthepolyclonalant
5、ibody．Theantibodytiterwas1：3200byELISA，andWest—ern·Blottingprovedthattheantiserumhadgoodspecificity．Bythemethodoforthogonalexperiment，theoptimalin—ducingexpressingconditionofACFAprotein：strainOD600value，IPTGfinalconcentration，inducingtimeandtem-perature，whichw
6、ere0．5，0．3mmol／L，8h，32℃，respectively；theoptimalculturecondition：glucoseconcentra—tion，rotationrate，andmediumvolume，whichwere0，230r／minand50mL，respectively．Keywords：Vibrioalginolyticus；ACFAprotein；Orthogonalexperiment；Polyclonalantibody溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)
7、為革蘭陰性菌，ACFs)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌致病菌毛調(diào)控蛋分布于海域、河口地區(qū)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖引起弧菌病暴發(fā)白?，研究發(fā)現(xiàn)其基因家族包括，、、a~C以的主要病原，發(fā)病率及死亡率高¨；也可引起人類及aCO，合成的蛋白增強(qiáng)其對小鼠腸道的黏附作胃腸道疾病與傷口感染；是一種人和海洋動(dòng)物共感用，同時(shí)提高毒性?。其中附著定植因子A(Ac—染的病原菌。目前，防治弧菌疾病主要使用抗cessorycolonizationfactorA，ACFA)是弧菌重要毒力生素，尚無商業(yè)化疫苗的生產(chǎn)，難以避免出現(xiàn)食蛋白之一，為d螺旋與無規(guī)則卷曲構(gòu)成的
8、分泌型蛋品安全與環(huán)境污染問題。白¨；c端表現(xiàn)出較強(qiáng)同源性，可能在蛋白跨膜結(jié)附著定植因子(Accessorycolonizationfactors，構(gòu)、維持細(xì)菌穩(wěn)定性，以及促進(jìn)細(xì)菌有效定植于宿主收稿日期：2014—09—05基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0723)；陜西理工學(xué)院人才啟動(dòng)項(xiàng)目(SLGQD13—15)作者簡介：劉祥(1983一
