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1、第34卷第1期華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)Vo1．34No．12015年1月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJan．2015，59~65萘降解菌的分離、鑒定及降解途徑徐中陽(yáng)陳雯莉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070摘要從武漢市金口張公堤處污泥富集分離出2株能以萘為唯一碳源生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)降解菌株XA1和XB1，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16SrDNA測(cè)序分析，確定它們屬于熒光假單胞菌(Pseudomonaspuorescens)。其最適生長(zhǎng)溫度均為28℃，最適生長(zhǎng)pH分別為7．5和7．0。在最適生長(zhǎng)條件下，菌
2、株XA1、XB1以3的接種量對(duì)500mg／L萘的降解率在第3天時(shí)分別達(dá)到了93．4和74．7。采用PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)到xA1、XB1中有兒茶酚2，3-雙加氧酶基因(nahH)等萘降解過程中的關(guān)鍵酶基因，與NCBI中發(fā)布的基因序列相比較，相似度均達(dá)到99。關(guān)鍵詞多環(huán)芳烴；萘；降解；兒茶酚2，3-雙加氧酶；熒光假單胞菌中圖分類號(hào)Q939．9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000—2421(2015)010059—07多環(huán)芳烴(PAHs)是由2個(gè)或2個(gè)以上的苯環(huán)從油田污泥中分離出萘降解菌株的研究在國(guó)內(nèi)還鮮以線形排列、彎曲連接或者聚簇狀的方式構(gòu)成的有見報(bào)道。本研究
3、以PAHs模式化合物萘為唯一碳機(jī)化學(xué)污染物，來源于石油、天然氣、煤炭、工業(yè)廢源，分離鑒定出2株熒光假單胞菌XA1和XB1，通水、廢氣等一些不完全燃燒的有機(jī)化合物中。由于過形態(tài)觀察和16SrDNA序列比對(duì)分析，對(duì)它們?cè)谄涓呤杷院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，容易在人體內(nèi)進(jìn)行富集，最優(yōu)條件下萘的降解效率和降解途徑進(jìn)行了測(cè)定和使人體致癌、致畸和致突變E，對(duì)人類健康和生態(tài)初步分析，以期為探討菌株XA1和XB1的分子降環(huán)境構(gòu)成重大危害，因此，被美國(guó)環(huán)保局列入了129解機(jī)制以及后期構(gòu)建高效降解PAHs的工程菌株種優(yōu)先控制環(huán)境污染物的黑名單[3]。盡管PAHs提供理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。是公
4、認(rèn)的難降解污染物，但已發(fā)現(xiàn)一些厭氧和好養(yǎng)1材料與方法微生物能夠通過多種代謝途徑將PAHs降解礦化，目前在污水、淤泥、土壤中均發(fā)現(xiàn)了能以PAHs為1．1試驗(yàn)材料唯一碳源和能源進(jìn)行降解的微生物，微生物在土樣：污泥樣品1、2、3號(hào)均于武漢市金口張公PAHs遷移乃至最終降解過程中起到了重要作用，堤處進(jìn)行定點(diǎn)采集，該處土壤長(zhǎng)期受多環(huán)芳烴污染，因此，PAHs的生物修復(fù)越來越受到人們的重采集深度分別為1號(hào)土(A點(diǎn))地下4m、2號(hào)土(B視l_4]。由于利用微生物降解PAHs的方法具有成點(diǎn))地下1m、3號(hào)土(C點(diǎn))地下3m，將采集到的土本低廉、二次污染少、修復(fù)徹底等優(yōu)點(diǎn)，已成
5、為去除樣放人無菌的牛皮紙袋中，密封，帶回實(shí)驗(yàn)室置于環(huán)境中PAHs的理想手段[6]。目前研究人員從土4℃冰箱保存。壤中分離的萘降解菌株主要有Mycobacteriumsp．，試劑：萘、環(huán)己烷、蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉、NaC1、Alcaligenesdenitrificans，Pseudomonasputida，CaC12、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、P．vesicularis，P．Zuorescens，Rhodococcussp．，F(xiàn)eCl。、甘油等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，Moraxellasp．等[7]。有研究表明，假
6、單胞菌所有試劑均為AR級(jí)；T4DNA連接酶購(gòu)于Fer—(Pseudomonassp．)能有效降解PAHs_g，但是關(guān)mentas公司，MarkerIl購(gòu)白天根生化科技有限公于該類高效快速的降解菌株報(bào)道的并不多，特別是司，引物、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自上海生物工程收稿日期：2013—05—28基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41071180)徐中陽(yáng)，碩士研究生．研究方向：土壤微生物學(xué)．E-mail：xzy2988970@163．corn通信作者：陳雯莉，博士，教授．研究方向：微生物學(xué)．E-mail：wlchen@mail．hzau．edu．cn60華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
7、學(xué)報(bào)第34卷技術(shù)有限公司。(500mg／L)無機(jī)鹽MM液體培養(yǎng)基，將XA1和1．2菌株的分離與培養(yǎng)XB1接種于LB培養(yǎng)基中過夜活化，取一定體積的將污泥土樣以l0的接種量接種于萘選擇性2種菌懸液，用PBS磷酸緩沖液反復(fù)洗滌3次，以無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(KH2POl_33g，K2HPO41．753的接種量接種于50mL含有萘(500mg／L)的無g，NH4Cl1．00g，Na2SO42．00g，KNO32．00g，機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組(CK)只加菌液不加萘，MgSO4·7H2O0．2g，F(xiàn)eSO4·7H2O0．05g，在28、37℃下180r／rain振蕩培養(yǎng)4d
8、，每隔12h測(cè)ZnSO4·H2O0．0428g，(N
